Механизмы действия редокс-активных соединений на биолюминесцентную биферментную систему НАД(Ф)Н: ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза

• Автор: Ветрова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 126 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение.

Глава. Литературный обзор

1.1. Строение и функционирование биолюминесцентной биферментной системы НАДФНФМНоксидоредуктазалюцифераза
1.1.1. Механизм хемилюминесцентной реакции, катализируемой бактериальной люциферазой

1.1.2. Взаимодействие люциферазы с субстратами реакции

1.1.3. Окислительновосстановительная реакция, катализируемая НАДФНФМНоксидоредуктазой.

1.1.4. Перенос ФМНН2 в биолюминесцентной системе.

1.2. Действие экзогенных соединений на биолюминесцентную биферментную систему НАДФНФМНоксидоредуктазалюцифераза.

1.3. Окислительновосстановительные свойства хинонов.

1.4. Биологическое значение редокс потенциала

Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Реактивы и материалы
2.2 Методы измерений.
2.2.1. Измерение биолюминесценции биферментной системы
АДФНФМНоксидоредуктазалюцифераза
2.2.2. Измерение свечения бактерий.
2.2.3. Измерение скорости окисления НАДН молекулами редоксактивных соединений, с использованием метода абсорбционной спектроскопии.
2.2.4. Исследование взаимодействия хинонов с люциферазой и НАДФНФМНоксидоредуктазой с использованием методов флуоресценции и анизотропии флуоресценции с временным разрешением
2.2.5. Измерения флуоресценции и анизотропии флуоресценции
при постоянном возбуждении.
2.3. Характеристики исследуемых хинонов
Глава 3. Механизмы ингибирования биолюминесценции биферментной системы НАДФНФМН оксидоредуктаза люцифераза редокс активными соединениями.
3.1. Акцептирование энергии молекулами хинонов в биолюминесцентной биферментной системе
3.2. Взаимодействие хинонов с люциферазой и НАДФНФМНоксидоредуктазой
3.3. Действие редоксактивных соединений на окислительновосстановительные процессы в биолюминесцентной биферментной системе
3.4. Закономерности влияния хинонов на биолюминесценцию биферментной системы
3.5. Сравнение действия на биолюминесценцию биферментной системы редокс пар хинон дифенол
3.6. Действие неорганических редокс активных соединений на биолюминесценцию биферментной системы.
3.7. Влияние редоксактивных соединений на биолюминесценцию светящихся бактерий.
Глава 4. Применение биолюминесцентных методов для тестирования
воды озера Шира.
4.1. Использование закономерностей действия редоксактивных соединений на биолюминесценцию биферментной системы
для тестирования воды озера.
4.2. Возможности использования биолюминесцентных биотестов в экологическом мониторинге озера Шира
Выводы.
Заключение.
Список литературы


Используя данные по мониторингу озера Шира. Определяющий вклад окислительновосстановительных процессов в изменении интенсивности биолюминесценции биферментной системы редоксактивными соединениями по сравнению с межмолекулярной миграции энергии возбуждения. Участие редоксактивных соединений в процессах ферментативного и неферментативного окисления НАДН определяет изменение кинетических параметров биолюминесценции биферментной системы индукционного периода и задержки выхода на максимум. Изменение флуоресцентных характеристик эндогенного флавина, связанного с ферментами, доказывает взаимодействие хинонов с ферментами биферментной системы. Принцип конструирования биолюминесцентных ферментативных тестовых систем, чувстви тельных к редокссостоянию среды, путем введения низкомолекулярных окислителей. Научная новизна. Впервые с физикохимических позиций детально рассмотрены механизмы действия редоксактивных соединений на биферментную систему НАДФНФМНоксидоредуктазалюцифераза, такие как влияние на НАДНзависимые процессы, взаимодействие с ферментами биолюминесцентной системы, межмолекулярный перенос энергии. Установлены вклады этих механизмов в ингибирование биолюминесценции редоксактивными соединениями. Установлены зависимости между физическими и физикохимическими характеристиками экзогенных молекул энергией электронновозбужденнных состояний, редокспотенциалом, наличием гидрофобных заместителей, скоростью окисления НАДН в ферментативных и неферментативных процессах и изменением кинетических параметров биолюминесценции биферментной системы. Показана возможность использования флуоресцентных характеристик эндогенного флавина для исследования взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной системы. Практическая значимость. Разработаны физикохимические основы биолюминесцентного тестирования редокссостояния природной воды, определяющие возможность прогнозирования результатов биолюминесцентного анализа. Показана возможность конструирования биолюминесцентных ферментативных тестовых систем, чувствительных к редокссостоянию среды, путем введения низкомолекулярных окислителей. Впервые биолюминесцентные биотесты адаптированы и применены для экологического мониторинга соленой воды озера Шира. Апробация работы. Биологической Физике Киото, Япония, 7ой Всероссийской научной конференция студентовфизиков и молодых ученых. Хемилюминесценция Болонья, Италия, Кембридж, Великобритания, . Работа выполнена при поддержке Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза, грант ЕС2, программа Фундаментальные исследования и высшее образование при поддержке грантов РФФИ 4, 3, 4мас, ИНТАС 9, КтШО 5, ФЦП А, КФН Б4М. Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов, и особенно научным руководителям и наставникам Кратасюк Валентине Александровне и Кудряшевой Надежде Степановне. Глава 1. В настоящее время полиферментные системы с бактериальной люциферазой интенсивно исследуются и широко используются в биолюминесцентном анализе Кратаскж Гительзон, Гительзон и др. Исследование систем с бактериальной люциферазой, включающих ряд сопряженных окислительновосстановительных реакций, представляет обширную область для моделирования механизмов сопряжения между ферментами и конструирования искусственных систем для аналитических целей Петушков и др. Для расширения круга анализируемых веществ, увеличения чувствительности биолюминесцентных систем, используют искусственные полиферментные системы с последовательной передачей восстановительных эквивалентов исходных субстратов до бактериальной люциферазы . Любой фермент, катализирующий синтез i vi субстрата люциферазы, образует с люциферазой сопряженную ферментативную систему реакций. К ним относятся ферменты, катализирующие реакции образования альдегида алкогольдегидрогеназа и редуктаза жирной кислоты, ФМН рибофлавинкиназа, ФМНН2 НАДФНФМНоксидоредуктаза.