Фотодинамическая инактивация ионных каналов, образованных мини-грамицидином в бислойной липидной мембране

• Автор: Дуцева, Елена Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура и функция грамицидина А

1.1.1 Структура грамицидина А в органических растворителях

1.1.2 Структура грамицидина в липидных мембранах

и мембраноподобных средах

1.1.3 Ионный канал грамицидина А в бислойных липидных мембранах

1.2 Миниграмицидин укороченный аналог грамицидина А

1.3 Фотосенсибилизированная инактивация ионных каналов

в бислойных липидных мембранах
1.3.1 Основы фотодинамической терапии
1 .3.2 Свойства фотосенсибилизаторов при фотодинамическом воздействии
1.3.3 Изучение кинетики распадаобразования канала грамицидина А методом сенсибилизированной фотоинактивации
1.3.4 Метод определения констант формирования и распада
каналов грамицидина в мембране, основанный на фотодинамическом воздействии
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1 Растворы фосфолипидов для формирования БЛМ
2 Буферные растворы
3 Каналоформеры
4 Фотосенсибилизаторы
5 Ячейки и электроды
6 Формирование БЛМ
7 Источники света
8 Измерение электрического тока через мембрану
9 Измерение потенциала липосом по изменению интенсивности флуоресценции сафранина
Приготовление липосом
Выделение митохондрий и эритроцитов
Устройство миниэкструдсра 3 РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Одиночные каналы миничрамицидина в липидной мембране
3.1.1 Изучение ионофорнон активности миниграмицидина
в БЛМ на уровне одиночных каналов
3.1.2 Влияние толщины мембраны на образование одиночных каналов миниграмицидина
3.2 Зависимость электрического тока от концентрации ковалентного димера миниграмицидина
3.3 Изучение свойств ионных каналов миниграмицидина методом сенсибилизированной фотоинактивации
3.3.1 Сравнение фоточувствительности миниграмицидина и его ковалентного димера
3.3.2 Исследование кинетики фотоинактивации миниграмицидина и его ковалентного димера в БЛМ
3.3.3 Исследование влияния толщины мембраны на характерное время фотоинактивации миниграмицидина .
3.3.4 Влияние толщины мембраны на характерное время фотоинактивации ковалентного димера миниграмицидина
3.4 Факторы, влияющие на характерное время фотоинактивации миниграмицидина
3.5 Влияние спонтанной кривизны липидов мембраны на ионофорную активность миниграмицидина
3.6 Изучение зависимости характерного времени фотоинактивации от величины индуцированного тока через мембран для миниграмицидина
3.7 Ионофорная активность миниграмицидина и грамицидина А в
липосомах
3.8 Сравнение действия миниграмицидина и грамицидина А на выделенные митохондрии
3.9 Действие миниграмицидина и грамицидина А на эритроциты
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Изучение взаимодействия пептидов с искусственными мембранами представляет большой интерес для понимания процессов фолдинга и работы мембранных белков в клетках, в том числе, механизмов функционирования ионных каналов. В модельных системах наиболее изучен ионный канал, образуемый антимикробным пептидом грамицидином А, который продуцируется i vi. Большой объем данных о грамицидине А получен методом регистрации одиночных каналов в БЛМ. Значительную информацию о свойствах грамицидиновых каналов удалось также получить с помощью метода фотосенсибилизированной инактивации. Изучение структурнофункциональных свойств грамицидина А позволило существенно продвинуться в понимании влияния мембраны на конформацию и свойства ионных каналов. В частности, была выдвинута концепция о зависимости свойств канала от соотношения между толщиной мембраны и длиной канала. Грамицидин А был выделен более полувека назад. Это пентадекапептид, формирующий в мембранах ионный канал, селективный к моновалентным катионам. Канал грамицидина А, представляющий по своей структуре димер голова к голове, является одним из самых популярных моделей биофизических исследований. Менее известно, что помимо данной структуры, грамицидин А способен формировать в мембранах и другие структуры, например двойную спираль, которая является доминирующей формой грамицидина в большинстве органических растворителей и в кристаллах. Свойства ионных каналов, имеющих такую структуру, изучены слабо. Грамицидин А широко применяется в биохимии как агент, выравнивающий ионные градиенты на биологических мембранах, в частности как разобщитель окислительного фосфорилирования в митохондриях и хлоропластах. В то же время в ряде работ было показано, что его действие не сводится лишь к деполяризации мембраны. Так Ягужинекий и соавторы на грамицидине, а Роттенберг и на его аналоге показали, что грамицидин в определеных условиях способен разобщать окисление и фосфорилирование без воздействия на мембранный потенциал. Помимо изучения грамицидина как простейшей модели ионного канала, проводятся также исследования аналогов грамицидина, направленные на изучение его антибактериального действия. К сожалению, его применение как антибиотика сдерживается его высокой токсичностью по отношению к эукариотическим клеткам. Этот недостаток теоретически может быть преодолен путем поиска соответствующего аналога грамицидина. В этом плане приобретает большое значение изучение функционирования различных аналогов грамицидина. С, так и с конца. конца. А в мембранах меньшей толщины. Данный результат достаточно интересен, поскольку известно, что толщина мембраны может регулировать активность природных каналов. В настоящей работе мы провели систематическое исследование механизма работы миниграмицидина и его ковалентного димера как на бислойных липидных мембранах, так и на липосомах и митохондриях. Для достижения этой цели было проведено всестороннее изучение реконструированных в искусственные бислойные липидные мембраны ионных каналов миниграмицидина и его ковалентного димера. Исследования биологических мембран представляют собой одно из важнейших направлений современной биологии. Играя ключевую роль в регуляции потоков вещества, энергии и информации в клетке, мембраны вовлечены во все без исключения стороны ее жизнедеятельности. Важная функция мембраны заключается в осуществлении взаимодействия клеток с внешней средой, что выражается в переносе ионов и молекул через мембрану. Ионные каналы, обеспечивающие транспорт ионов через биологические мембраны, играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клеток и тканей организма. Согласно жидкомозаичной модели Сингера и Николсона рис. Мюллером и коллегами 1 рис. Этот метод позволяет формировать плоские липидные бислои макроскопических размеров, изучать их физические свойства и фиксировать изменения проводимости мембраны, индуцированные одиночными молекулами каналоформера. Рис. Схематическое изображение липидной мембраны, окружающей клетку. Согласно жидкомозаичной модели Сингера и Николсона 2.