Физико-химические свойства пируватдекарбоксилазы и её субстрата в реакциях ферментативного и фотохимического декарбоксилирования

• Автор: Заводник, Илья Борисович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Гродно
• Количество страниц: 189 c. : ил

1.1. Общая характеристика тиаминзависимых реакций

1.2. Механизм реакции декарбоксилирования пировиноградной кислоты классическая схема

1.3. Физикохимические характеристики тиамина .

1.4. Взаимодействие тиаминпирофосфата с ионами металлов

1.5. Роль свободнорадикальных реакций и процессов переноса электрона в механизме тиаминового катализа .
ГЛАВА 2. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПИРОШГОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ СУБСТРАТА ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ

2.1. Структура и спектральные свойства шровиноград

ной кислоты в органических растворителях

2.2. Структура пировиноградной кислоты в водных растворах. Обратимая гидратация пировиноградной кислоты .

2.3. Фотохимическое декарбоксилирование пировиноградной кислоты.

ГЛАВА 3. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ

3.1. Общие свойства и структура пируватдекарбоксилазы
3.2. Регуляция каталитической активности пируватдекарбоксилазы .
3.3. Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с кофак
торами, субстратом и продуктом реакции ацет
альдегидом
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ.
НАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, МЕТОДЫ И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
4.1. Объекты исследования
4.2. Выделение пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей .
4.3. Приборы и техника эксперимента .
4.4. Химическая модификация белков.
4.5. Фотохимические превращения пировиноградной кислоты ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
ГЛАВА 5. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ
5.1. Спектральнолюминесцентные свойства пировиноградной кислоты в органических растворителях и их связь со структурой молекулы.
5.2. Состояние и люминесцентные свойства пировиноградной кислоты в водных растворах
ГЛАВА 6. ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ПИРОШНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ
6.1. Механизм фотодекарбоксилирования пировиноградной кислоты в водных растворах
6.2. Влияние тиамина на фотодекарбоксилирование пировиноградной кислоты
6.3. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты в фотохимической и ферментативной реакциях .
ГЛАВА 7. НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ
7.1. Флуоресценция пируватдекарбоксилазы. индуцируе
мые конформационные перестройки молекулы фермента
7.2. Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с субстратом
и ионами металлов
7.3. Взаимодействие тиаминпирофосфата с ионами металлов
7.4. Некоторые регуляторные свойства пируватдекарбоксилазы
7.5. Влияние температуры на скорость реакции, катализируемой пируватдекарбоксилазой. Роль внутриглобулярной подвижности .
ГЛАВА 8. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ С АЩ7ГАЛЬДЕГИДОМ
8.1. Необратимое ингибирование пируватдекарбоксилазы продуктом реакции ацетальдегидом
8.2. Механизм взаимодействия ацетальдегида с белком
8.3. Изучение взаимодействия карбонилсодержащих соединений с белком методом флуоресцентной метки
ЧАСТЬ 1У. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Все известные к настоящему времени реакции, катализируемые ферментами, содержащими ТПФ, представляют важный класс синтеза и расщепления углеродуглеродной связи, причм расщепляемая или синтезируемая связь находится в непосредственном соседстве с карбонильной группой реакции альдольного синтеза и альдольного разуплотнения. Общим этапом всех катализируемых реак
ций является образование остатка альдегида, связанного с коферментом. К СО СН0НЯ СНО ОНО I . Простое неокислительное декарбоксилирование Лкетокислот, катализируемое тиаминзависимым ферментом пируватдекарбоксилазой КФ 4. В результате неокислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты ПК в среду в свободном видевыделяется ацетальдегид АА. Одновременно образуется углекислый газ СНдСОСООН СНдСНО С 4, 2. При окислительном декарбоксилировании ПК продуктом реакции может быть уксусная кислота. Этот процесс катализирует тиаминзависимый фермент пируватоксидаза 8. Однако, подобно образованию ацетальдегида, образование ацетата из пировиноградной кислоты, характерно для микроорганизмов. Животным тканям соответствует окислительное декарбоксилирование оСкетокислоты, идущее с образованием ацетилКоА. Типичным представителем этого класса реакций является окислительное декарбоксилирование ПК, катализируемое пируватдегидрогеназным
комплексом КФ 1. Пируватдегидрогеназный комплекс контролирует процесс аэробного окисления углеводов. Катализируемая им реакция включает ряд последовательных стадий, осуществляемых тремя индивидуальными ферментами, объединенными в упорядоченный комплекс пируватдекарбоксилазой, требующей в качестве кофакторов ТПФ и ионы магния, липоилтрансацетилазой и липоилдегидрогеназой. Важным представителем ТПФзависимых ферментов является транскетолаза КФ 2. При е участии осуществляются реакции неокислительного образования пентозофосфатов или реакции ассимиляции пентозофосфатов при функционировании глгокозомонофосфатного окислительного шунта. Катализирует транскетолаза расщепление и образование кетосоединений путем переноса гликолевого альдегида с кетосахаров субстратдонор на альдосахара субстратакцептор , 7. Фосфокетолаза КФ 4. Этот фермент обнаружен у микроорганизмов 7. Приведнный неполный перечень процессов, катализируемых тиаминпирофосфатзависимыми ферментами, свидетельствует о ключевой роли этих ферментов в метаболизме клетки. История открытия и изучения коферментных функций ТПФ является историей современной витаминологии. Бреслоу в г. Бреслоу связал высокую скорость обмена протона у атома углерода, заключнного между двумя гетероатомами Б и тиазолового цикла с каталитическими свойствами тиамина в реакции ацилоиновой конденсации . Им было предположено, что катализ тиазолием сходен с ацилоиновой конденсацией, катализируемой СМионами. Предложенная Бреслоу последовательность этапов взаимодействия тиамина с ПКсубстратом является общепринятой , , 7. В основе этой схемы лежат следующие этапы I ионизация тиазолового кольца тиамина с образованием 2карбаниона, имеющего илидный характер 2 присоединение к карбаниону поляризованного карбонильного углерода ПК или другой обкетокислоты 3 декарбоксилирование этого промежуточного соединения с образованием ионизированной формы 2обоксиэтилтиамина об карбаниона схема I. Предложенная схема была подтверждена в дальнейшем целым рядом экспериментов. Мецлер с соавт. ПК в модельной системе необходимо тиазолиевое кольцо, не содержащее заместителей в положении 2 7. Активный ацетальдегид 2об оксиэтилтиаминпирофосфат и активный пируват 2 об оксиэтил обкарбокситиаминлирофосфат были хроматографически идентифицированы в работающей пируватдекарбоксилазной системе 6, 4. Была подтверждена высокая реакционность протона во втором положении тиазолиевого кольца 9. ПК и ТПФ 0, 1. Подученные в последнее время различными авторами результаты позволили уточнить многие существенные детали механизма катализа. Истинным промежуточным продуктом реакции считается не 2Л оксиэтилтиаминпирофосфат, а остающийся в активном центре фермента после декарбоксилированяя первичный и карбанион , . Само соединение 2Х оксиэтил ТПФ можно рассматривать как побочный продукт нефизиологической реакции, протекающей в отсутствии соответствующих акцепторов альдегида.