Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих

• Автор: Холмухамедов, Эхсон Лукманович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 Энергозависимый транспорт ионов Са2 в митохондриях

Глава 2 Митохондриальный механизм действия диазоксида и пинацидила

Глава 3 Роль пориновых каналов в регуляции функций митохондрий

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение препарата изолированных митохондрий

Измерение характеристик изолированных митохондрий

Измерение переноса меченых протонов 3Н через хлороформ

Характеристики ишемического повреждения сердечной мышцы

Культивирование клеток

Пермеабилизация плазматической мембраны гепатоцитов
Измерение ферментативных активностей
Измерение проницаемости внешней мембраны митохондрий
Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ
ЧАСТЬ 1 МИТОХОНДРИИ В РЕГУЛЯЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ
1.1 Общие принципы и особенности транспорта Са2 в митохондриях
1.1.1 Колебания ионных потоков в митохондриях
1.1.2 Математическая модель колебаний ионных потоков в митохондриях
1.2 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2
1.2.1 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2
1.2.2 Волны сокращениянабухания в неперемешиваемом слое митохондрий
1.3 Участие митохондрий во внутриклеточной Са2 сигнализации
1.3.1 Участие митохондрий в регуляции концентрации Са2 в клетках
1.3.2 Участие митохондрии в синхронизации Са2 волн в клетке.
1.3.3 Зависимость амплитуды Са2 волны от состояния митохондрий
1.3.4 Восстановление амплитуды и синхронности Са2 волн
Заключение
ЧАСТЬ 2 МИТОХОНДРИИ В МЕХАНИЗМЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
2.1 Влияние диазоксида и пинацидила на функции митохондрий
2 1.1 Деполяризующее действие активаторов КАТФ каналов на митохондрии
2.1.2 Действие диазоксида и пинацидила на дыхание митохондрий
2.1.3 Действие диазоксида и пинацидила на синтез АТФ в митохондриях
2.2 Влияние диазоксида и пинацидила на транспорт Са2 в митохондриях
2.2.1 Диазоксид и пинацидил подавляют накопления Са2 в митохондриях
2.2.2 Диазоксид и пинацидил усиливают выход ионов Са2 из митохондрий
2.2.3 Действие диазоксида и пинацидила на Са2зависимое открывание поры
2.2.4 Зависимость действия диазоксида и пинацидила от ионов К в среде
2.2.5 АТФ иили АДФ ингибируют эффект диазоксида и пинацидила
2.3 Влияние диазоксида и пинацидила на митохондриальныймембранный
ПОТЕНЦИАЛ И СОДЕРЖАНИЕ СА2 В КАРДИОМИОЦИТАХ
2.3.1 Диазоксид и пинацидил деполяризуют митохондрии в кардиомиоцитах
2.3.2 Диазоксид и пинацидил снижают митохондриальный Са2 в клетках
2.4 Протонофорный механизм действия активаторов КАтф каналов
2.4.1 Общие закономерности действия диазоксида, пинацидила и 2,4ДНФ на митохондриальные дыхание, мембранный потенциал и синтез АТФ
2.4.2 Диазоксид, пинацидил и ДНФ переносят Н через гидрофобную фазу
2.4.3 Разобщение митохондрий уменьшает ишемическое повреждение Заключение
ЧАСТЬ 3 РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В ФИЗИОЛОГИИ МИТОХОНДРИЙ
3.1 Окисление этанола закрывает пориновые каналы в внешней мембране митохондрий печени
3.1.1 Действие этанола и продуктов его окисления на основные функции митохондрий
3.1.2 Пермеабилизация клеточной и внешней митохондриальной мембран
3.1.3 Дигитонин обращает эффект ингибирования пориновых каналов
3.1.4 Окисление этанола закрывает пориновые каналы
3.1.5 Оценка пориновых каналов с помощью конфокальной микроскопии
3.1.6 Прохождение флуоресцентных молекул 3 кДа декстрана в межмембранное пространство
3.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в первичной культуре
гепатоцитов КРЫСЫ
3.2.1 Участие митохондрий в реакциях цикла мочевины
3.2.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в гепатоцитах
3.2.3 Действие ингибиторов окислении этанола на синтез мочевины
3.2.4 Действие ингибиторов РЗ киназы и аденозинА1 рецепторов на синтез мочевины
3.3 Этанол подавляет обмен метильных групп в гепатоцитах крысы
3.3.1 Митохондриальная система метаболизма глицина
3.3.2 Ядерная магнитная спектроскопия С изотопомеров сери на
3.3.3 Окисление этанола подавляет митохондриальный синтез серина
Заключение
ЧАСТЬ 4 РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В ФИЗИОЛОГИИ КЛЕТОК
4.1 Закрывание пориновых каналов увеличивает чувствительность клеток к
ПРОГРАММИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ АПОПТОЗУ
4.1.1 Закрывание пориновых каналов активирует МРТ пору
4.1.2 Закрывание пориновых каналов индуцирует окислительный стресс
4.1.3 Генетический нокаут белковпоринов увеличивает чувствительность клеток к адафостину
Заключение
ПРИЛОЖЕНИЕ
Разработка и синтез новой флуоресцентной пробы для оценки проницаемости
пориновых каналов
Принципиальная схема создания пориновой флуоресцентной пробы
Использование флуоресцентной пробы для оценки состояния пориновых каналов в митохондриях внутри интактных клеток
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Все эти этапы генерации колебаний, подтвержденные экспериментально, позволили нам создать математическую модель процесса колебаний ионных потоков и объема в митохондриях. Таким образом, в конце х началу х годов основные черты процесса колебаний ионных потоков в митохондриях и необходимость участия в колебаниях ионов кальция были выявлены, однако полного понимания самого механизма и физиологической ролинеобходимости в этих колебаниях не было. Участие ионов кальция в этих колебаниях указывало на возможную физиологическую важность процесса колебаний в целом. Однако в эти годы предположение о возможности регуляции концентрации свободного Са2 в цитозоле митохондриями не выдержало экспериментальной проверки. Участие митохондрий в регуляции внутриклеточной концентрации Са2 было опровергнуто экспериментами Ленинджера с коллегами . Эти авторы экспериментально определили вклад эндоплазматического ретикулума и митохондрий в поддержании концентрации свободного кальция в пермеабилизованных гепатоцитах печени крысы и показали, что митохондрии связывают намного больше кальция, чем эндоплазматический ретикулум, хотя и с гораздо меньшим сродством. На этом основании был сделан вывод о том, что концентрация свободного кальция в цитоплазме определяется эндоплазматической кальциевой АТФазой, а не митохондриями . Эти данные были первой экспериментальной проверкой участия митохондрий в регуляции внутриклеточной концентрации ионов Са2 и были настолько убедительными, что на десятилетия затормозили понимание истинной роли кальция в регуляции функций митохондрий в клетках млекопитающих. До середины х годов все работы по изучению роли митохондрий в клетках были сосредоточены на выяснении особенностей и деталей механизма окислительного фосфорилирования 8 . До недавнего времени считалось, что участие митохондрий в Са2 гомеостазе клетки ограничено Са2зависимой активацией матриксных ферментов, которое транслируется в усиленное производство АТФ . Было установлено, что транспорт ионов кальция в изолированных митохондриях происходит в две фазы. Первая фаза это энергозависимое накопление добавленных ионов в матриксе митохондрий, стимуляция дыхания и выброс протонов из матрикса. Во второй фазе, накопленные ионы кальция начинают выходить из матрикса и, через некоторое время, наблюдается быстрое увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий, обратный захват ионов водорода и высвобождение из матрикса ионов К Эти авторы впервые продемонстрировали, что активное, энергозависимое накопление ионов Са2 в митохондриях сопровождается драматическими изменениями как морфологии, так и функций митохондрий, спонтанными структурными перестройками во внутренней и внешней мембранах и, что особенно важно, приводит к изменению проницаемости внутренней мембраны митохондрий к водорастворимым молекулам размером Да и высокоамплитудному набуханию матрикса вследствие открывания большой неспецифической поры во внутренней мембране и коллоидоосмотического увеличения объема матрикса . Вначале оставшееся незамеченным, это явление Са2зависимого увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий и высокоамплитудного набухания с освобождением факторов, определяющих судьбы клеток, послужило толчком к тысячам работ, в которых изучаются молекулярная структура этой неспецифической поры и механизмы ее открывания . Дальнейшие исследования показали, что накопление ионов Са2 в матриксе митохондрий является необходимым условием изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий к водорастворимым молекулам, которое приводит к высвобождению из матрикса не только накопленных ионов кальция, но также и всех малых ионов калия, водорода, приводя к равновесию их концентраций . С помощью электронной микроскопии было обнаружено, что наблюдаемое изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрии сопровождается изменением структуру и морфологии митохондрий. Это явление было названо 2i ii ii ii , а изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрий, которое связано с открыванием поры, получило название ii ii роге РТР . В дальнейшем мы будем использовать эту аббревиатуру, без перевода на русский язык, как получившую всеобщее признание.