Мембранные белки семейства KCNE: создание эффективных бактериальных штаммов-продуцентов, очистка и изучение структурных особенностей

• Автор: Гончарук, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.И

Калиевые каналы и белки семейства КСЫЕ

Потенциалзависимые калиевые каналы.

Белки семейства КСЫЕ

КСЫЕ1 МпК.
КСЫЕ2 МКР1
КСЫЕЗ МКР2

Разнообразие МКРов

ЯМРспекгроскопия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы.
Штаммы Е.со
Вектора и плазмиды.
Средьт для выращивания микроорганизмов.
Ферменты.
Реактивы.
Буферы для выделения белков
Олигонуклеотиды
Основные генноинженерные методики.
Полимеразная цепная реакция ПЦР.
Рестрикция
Лигирование.
ДНКэлектрофорез
Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.
Выделение плазмидной ДНК из . i.
ПЦР анализ клонов.
Секвестрование ДНК
I трансформация клеток . i плазмидной ДНК.
Конструирование экспрессионных векторов.
X1i.
XНб.
i Е2Н6.
Xi3 ,
Денатурирующий электрофорез белков
Подбор условий индукции.
Выращивание рекомбинантного штамма . i
Выделение белков
16
26
Солюбилизация белков
КДспектроскопия
Динамическое светорассеяние.
ЯМРспектрос копия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Создание эффективных систем экспрессии генов сКСМЕ, КСЫЕ1,
КСЫЕ2 и КСЫЕЗ
аКСЫЕ.
КСЫЕ2
Разработка эффективных систем очистки
Отмывка телец включения схема 1, А.
Металлохелатная аффинная хроматография схема 1, Б
Расщепление гибридных белков схема 1, В
Разделение продуктов гидролиза схема 1, Г
Дополнительная очистка схема 1, Д
Структурные исследования.
Удаление детергента
Выбор мембраиоподобиого окружения
ЯМРспектроскопия
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Автор выражает свою глубокую признательность научному руководителю академику Михаилу Петровичу Кирпичникову за проявленное внимание и содействие в выполнении работы. От души благодарит к. Алексея Анатольевича Шульгу и к. Ярослава Станиславовича Ермолюка за легкую атмосферу, созданную ими в Лаборатории, которая распола1ала к творческой работе автора. Автор искренне благодарит весь остальной коллектив Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН, в особенности Елену Николаевну Ткач за помощь, отзывчивость, доброжелательность и ценные советы, которые были приняты во внимание при подготовке автором диссертационной работы и автореферата к публикации. Автор глубоко признателен д. Александру Сергеевичу Арсеньеву, д. Роману Гсрбертовичу Ефремову, к. Эдуарду Валерьевичу Бочарову и к. Дмитрию Евгеньевичу Нольде за стимулирующие дискуссии, критические замечания, внимание, помощь, поддержку и доверие. Автор благодарит Елену Олеговну Артеменко и д. Алексея Валерьевича Феофанова за полезные советы и помощь в снятии спектров КД Владимира Александровича Соболя за помощь в интерпретации данных, а также за измерение спектров ЯМР, их обработку и расчет пространственной структуры КСЫЕЗ Павла Константиновича Кузьмичева и д. Владимира Владимировича Чупина за получение спектров динамического светорассеяния. Кроме того, автор выражает искреннюю признательность всему сплоченному коллективу Отдела структурной биологии ИБХ РАН за поддержку, благожелательное отношение и внимание, а также благодарит всех профессоров, доцентов и сотрудников Кафедры физикохимической биологии и биотехнологии МФТИ ГУ, УчебноНаучного Центра ИБХ РАН. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ. ВВЕДЕНИЕ. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Потенциалзависимые калиевые каналы. КСЫЕ1 МпК. ЯМРспекгроскопия. Материалы. Штаммы Е. Вектора и плазмиды. Средьт для выращивания микроорганизмов. Ферменты. Реактивы. Основные генноинженерные методики. Полимеразная цепная реакция ПЦР. Лигирование. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей. Выделение плазмидной ДНК из . ПЦР анализ клонов. I трансформация клеток ДНК. Конструирование экспрессионных векторов. X1i. XНб. i Е2Н6. Подбор условий индукции. Выращивание рекомбинантного штамма . 3. Динамическое светорассеяние. ЯМРспектрос копия. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. КСЫЕ Отмывка телец включения схема 1, А. Структурные исследования. Мембранные белки МБ составляют более четверти всех белков, кодируемых геномом человека. Они представляют собой существенную часть биологической мембраны и участвуют во многих процессах жизнедеятельности клетки. Именно МБ ответственны за передачу сигналов, производство и преобразование энергии, распознавание и транспорт веществ через мембрану. Дисфункции МБ нередко лежат в основе различных заболеваний. Это делает МБ исключительно привлекательными объектами разработки лекарственных препаратов. В настоящее время действие приблизительно лекарств направлено именно на МБ. Знание пространственной структуры МБ, а также механизмов их функционирования, способствовало бы более глубокому пониманию биологических процессов и заложило бы основу для рационального дизайна лекарственных препаратов. Несмотря на то, что в последнее время были достигнуты немалые успехи в изучении структуры и функции различных МБ, очень многое ещ предстоит сделать. Среди огромного разнообразия данных о пространственной структуре водорастворимых белков в i данные о МБ составляют лишь 1 от общего числа. Главным образом, подобная ситуация связана с отсутствием эффективных технологий получения МБ. Если на сегодняшний день рекомбинантные водорастворимые белки можно синтезировать в любых количествах и без особых сложностей, то наработка каждого нового функциональноактивного МБ в количествах, достаточных для физикохимических методов исследования, является значимым событием для структурных биологов. Существует три основных способа получения МБ.