Основные белки митохондрий и их роль в сохранении митохондриальной ДНК

• Автор: Гуляева, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МтДНК чувствительная мишень для эндогенных и

экзогенных повреждающих агентов.

1.2. ДНКсвязывающие белки ядер и их роль в обеспечении

защиты ядерного генома от действия повреждающих агентов.

1.3. ДНКсвязывающие белки митохондрий клеток млекопитающих. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2. Основные химические реактивы.

2.3. Радиационная обработка.
2.4. Выделение митохондрий и ядер из тканей крыс и мышей.
2.5. Очистка митохондрий в градиенте сахарозы.
2.6. Очистка митохондрий с использованием дигитонина.
2.7. Получение нуклеоидов митохондрий.
2.8. Выделение кислоторастворимых белков митохондрий и гистонов ядер из печени и селезенки.
2.9. Очистка белков на ДЭАЭцеллюлозе.
2 Получение ДНКбелковых комплексов i vi,
2 Обработка ДНКбелковых комплексов перекисью водорода.
2 Исследование образования ДНКбелковых комплексов с помощью актиномицина Д.
2 Выделение мтДНК с использованием фенола.
2 Выделение мтДНК на магнитных сорбентах.
2 электрофорез белков в полиакриламидном геле.
2 Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2 Определение количества ДНКбелковых сшивок.
2 Определение АДФрибозосинтетазной активности.
2 Определение концентрации белка.
2 Определение концентрации ДНК спектрофотометрическим методом.
2 Определение содержания ДНК флуоресцентным методом.
2 Статистическая обработка.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Основные кислоторастворимыс белки в митохондриях.
3.2. Исследование комплексирования основных белков митохондрий с ДНК
i vi.
3.3. Выяснение возможной ассоциации белков и мтДНК в митохондриях i viv.
3.3.1. Формирование ДНКбел ковых сшивок в митохондриях тканей
крыс, подвергнутых радиационному воздействию.
3.3.2. Активация полиАДФрибозилирования белков в митохондриях тканей крыс, подвергнутых радиационному воздействию.
3.4. Участие белков нуклеоидов митохондрий в защите мтДНК при действии повреждающих агентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Известно, что я ДНК в клетках высших организмов в значительной мере экранирована гистонами и негистоновыми белками от действия АФК и других повреждающих агентов. Эти белки обеспечивают компактную укладку яДНК в составе хроматина, ее структурную организацию и функционирование. Значительная часть негистоновых белков в хроматине представлена ферментами и полипептидами, регулирующими функционирование ДНК , i . О прочной ассоциации этих белков с ДНК в составе ядерного хроматина свидетельствует то, что при действии окислителей или других агентов на клетки образуются ДНКбелковые сшивки ДБС. Известно также, что ДНК в клетках бактерий комплексирована с белками, в том числе гистоноподобными, формируя нуклеоид или бактериальный хроматин Ii, v ivii, . Топология структуры хроматина клеток высших организмов и нуклеоида бактериальных клеток меняется в зависимости от функционирования процессов репликации, рекомбинации, репарации и транскрипции в клетках. Гистоны и негистоновые белки хроматина, а также белки в составе бактериальных нуклеоидов являются кислоторастворимыми, что дает методическое преимущество для их экстрагирования и анализа , . Что касается мтДНК, то вопросы о ее структурнофункциональной организации в митохондриях и возможности формирования комплексов мтДНК с белками, способными снижать атаки АФК и других повреждающих агентов на митохондриальный геном, к началу наших исследований оставались не достаточно ясными. Развитие исследований в этом направлении важно для понимания путей защиты, сохранения генетического материала в митохондриях, косвенно участвующего в регуляции множества клеточных процессов. Более того, хорошо установлено, что накопление значительного количества повреждений в мтДНК клеток приводит к ухудшению энергозависимого метаболизма в тканях, развитию различных патологий нейропатии, миопатии, кардиопатии, диабета, дегенеративных процессов, ускорению старения и гибели клеток x i , . ДНК в условиях повышенного окислительного стресса. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании ДНКсвязывающих основных белков митохондрий клеток млекопитающих и способности этих белков в составе ДНКбелковых комплексов снижать повреждения мтДНК. Выяснить наличие ДНКсвязывающих основных белков в митохондриях тканей крыс, определить их состав и способность формировать комплексы с ДНК i vi. Исследовать ДНКбелковые комплексы в митохондриях i viv по формированию ДНКбелковых сшивок и активации полиАДФрибозилирования белков, индуцируемых ионизирующим излучением. Исследовать способность основных белков митохондриальных нуклеоидов снижать уровень повреждений мтДНК, индуцируемых перекисью водорода и ионизирующей радиацией. Научная новизна работы. Впервые установлено, что митохондрии млекопитающих содержат более основных ДНКсвязывающих полипептидов, которые образуют комплексы с ДНК i vi, аналогично ядерным гистонам. Впервые показано, что ионизирующая радиация вызывает образование ДНКбелковых сшивок и активацию полиАДФрибозилирования белков в митохондриях тканей облученных животных, также как и в ядрах, что свидетельствует о существовании i viv в митохондриях ДНКбелковых комплексов и связи мтДНК с полиАДФрибозилполимеразой, активируемой при возникновении разрывов цепей мтДНК. ДНК и формирующие с ней компактные структуры нуклеоиды, обеспечивают защиту митохондриального генома, как и гистоны яДНК, от повреждающего действия ионизирующего излучения и перекиси водорода. Практическая ценность работы. Представленные в настоящей работе результаты исследования имеют существенное значение для понимания путей защиты, сохранения генетического материала митохондрий, участвующего в регуляции множества клеточных процессов. Результаты этой работы представляют несомненный практический интерес, поскольку могут быть использованы при разработке способов повышения устойчивости мтДНК, регуляции энергозависимых процессов и метаболической коррекции различных патологий.