Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток

• Автор: Браже, Надежда Александровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ б

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Свойства оксида азота и его источники в организме.

1.1.1 Синтез 0 в организме

1.1.2 Физикохимические свойства оксида азота.

1.2 Функции оксида азота в нервной системе.

1.2.1 Роль 0 в регуляции электрофизиологической активности нейронов и

синаптической передаче

1.2.2 Роль 0 в регуляции внутриклеточных процессов.

1.2.3 Роль 0 в регуляции межклеточных взаимодействий.

1.2.4 Нейрозащитные и нейродеструктивные свойства 0
1.2.5 Роль 0 в нервной системе беспозвоночных животных
1.3 Роль 0 в регуляции переноса кислорода эритроцитами
1.3.1 Действие 0 на сосуды.
1.3.2 Взаимодействие 0 с гемоглобином эритроцитов
2 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Приготовление препаратов. Растворы и реактивы
3.1.1 Приготовление препаратов нервной системы пиявки.
3.1.2 Приготовление препаратов нервной системы прудовика
3.1.3 Приготовление препаратов миелиновых нервных волокон.
3.1.4 Доноры оксида азота.
3.1.5 Создание церебральной ишемии и ностишемической реперфузии у крыс
3.2 Регистрация активности одиночных ионных каналов
3.3 Регистрация электрофизиологических характеристик нервных волокон
3.4 Микрофлуориметрические исследования свойств нейронов
3.4.1 Регистрация изменений количества Са2, связанного на плазматической
мембране и во внутриклеточных компартментах.
3.4.2 Регистрация изменений потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов.
3.4.3 Регистрация изменений содержания окисленных флавопротеинов в нейронах .
3.4.4 Математическая обработка результатов флуоресцентных исследований
3.5 Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
3.6 Регистрация спектров поглощения нейронов
3.7 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния.
3.7.1 Применение спектроскопии РКР для исследования микровязкости клеточных мембран.
3.7.2 Применение спектроскопии КР для исследования конформации гемопорфирина гемоглобина и Огсвязмвающих свойств гемоглобина
3.8 Метод лазерной интерференционной микроскопии и вейвлетанализ.
3.8.1 Применение лазерной интерференционной микроскопии для исследования интегральных свойств плазматической мембраны и цитоплазмы нейронов.
3.8.2 Анализ динамики локальных значений показателя
преломления нейронов .
3.9 Метод электронного парамагнитного резонанса.
4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Влияние оксида азота на свойства плазматической мембраны нейронов и нервных волокон.
4.1.1 Действие 0 на активность потенциалзависимых Кканалов нейронов
4.1.2 Действие 0 на электрофизиологические характеристики нервных волокон .
4.1.3 Перераспределение Са2, связанного на плазматической мембране нейронов и нервных волокон при действии 0
4.1.4 Действие 0 на микровязкость плазматической мембраны нервных волокон .
4.2 Действие оксида азота на функциональное состояние внутриклеточных органоидов нейронов.
4.2.1 Влияние 0 на потенциал внутренней мембраны митохондрий нейронов
и содержание окисленныхвосстановленных флавопротеинов
4.2.2 Локальные изменения потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при действии 0.
4.2.3 Изменение содержания Са2, связанного во внутриклеточных компартментах, и вязкости мембраны цитосом нейронов при действии 0 .
4.3 Действие оксида азота на оптические свойства нейронов.
4.3.1 Влияние 0 на изменения показателя преломления нейронов в примембранной области.
4.3.2 Влияние 0 на локальные изменения показателя преломления нейронов в области цитоплазмы
4.3 3 Анализ характерных частот динамики показателя преломления нейронов
4.4 Действие оксида азота на свойства эритроцитов
4.4.1 Влияние доноров 0 на кислородсвязывающие свойства гемоглобина
и микровязкость плазматической мембраны эритроцитов
4.4.2 Изменение кислородсвязывающих свойств гемоглобина и вязкости плазматической мембраны эритроцитов при церебральной ишемии и постишемической рсперфузии у крыс
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6 ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


На первом связываются ФАД, ФМН, Са2кальмодулин и подвергается окислению НАДФН, на втором связываются протопорфирин и тетрагидробиоптерин и осуществляется синтез 0 из аргинина. На рис. Предварительно к азоту присоединяется кислород О2 и образуется промежуточный продукт КТигидроксиаргинин . Далее по неизвестному механизму отщепляется 0 и остается аминокислота цитруллин. Побочным продуктом может быть супероксидрадикал кислород перехватывает электрон с флавинов и образуется При больших концентрациях кислорода эта реакция из побочной может становиться основной. В течение длительного времени велись споры, что же синтезируют синтазы 0, 0 или 0. Цитруллин
Рис. Схема строения М0синтазы с кофакторами и потоком электронов от редуктазного домена к оксидазному. Цифрами указаны значения окислительновосстановительных потенциалов кофакторов. СОД. Было предположено, что в результате синтеза образуется нитроксил 0, превращающийся в 0 под действием СОД. Однако эта гипотеза не была принята. Действительно, СОД убирает О2, который быстро реагирует с 0 и образует пероксинитрит Ч . В последствие было показано, что основной продукт синтеза 0 именно 0, а 0, как и ОГЮО, является побочным продуктом реакции . Чрезмерно большие, как и очень малые, концентрации 0 приводят к гибели клеток, поэтому существует сложная система аллостерической и ковалентной регуляций активности 1Юсинтаз. Прежде всего, существует автоингибирование фермента под действием 0 . Аллостерическая регуляция осуществляется при помощи Са2 4кальмодулина для конститутивных синтаз и Са2 для индуцибельной. СаМ связывается с редуктазным доменом конститутивных М0синтаз, в результате чего увеличивается скорость переноса электрона от НАДФН к ФАДН и от ФМНН2 к протопорфирину . К такому же эффекту приводит связывание Са2 с кальмодулином ьГОБ. Эндотелиальная синтаза также аллостерически активируется белком теплового шока . Фосфорилирование оказывает активационный эффект для эндотелиальной К0синтазы и ингибирующий для нейрональной. Последняя, кроме этого, инактивируется при ковалентном связывании специального белкаингибитора . Эндотелиальная ГЮсинтаза ингибируется при связывании подмембранным белком кавеолином, а взаимодействие синтазы с СаМ переводит ее в активное состояние . Во многих случаях это является причиной клеточной гибели. Предполагается, что смерть нейронов, вызываемая глутаматом в больших концентрациях, связана не столько с нарушением Са2систем клетки, сколько с образующимися оксидом азота и пероксинитритом . Тем не менее, полное выключение синтаз приводит к гибели показано, что животные, нокаутированные по гену любой изоформы, почти нежизнеспособны и быстро умирают. Сравнительно недавно была обнаружена синтаза в митохондриях нервных, глиальных, мышечных, эндотелиальных и других клеток . Анализ аминокислотной последовательности показал, что она является вариантом нейрональной 0синтазы с двумя посттрансляционными модификациями ацилированием миристиновой кислотой, что способствует прикреплению фермента ко внутренней митохондриальной мембране, а также фосфорнлированием остатка серотонина, которое активирует продукцию 0 . Предполагается, что участвует в регуляции электронного транспорта в электронтранспортной ЭТЦ, дыхательной цепи митохондрий, а при больших количествах производимого 0 может приводить к патологическим процессам 9, . В организме оксид азота образуется не только при синтезе, осуществляемом 0синтазами. Существует дополнительный путь образования 0 восстановление нитритов, происходящее при окислении дезоксигемоглобина дГб или при участии дыхательной цепи митохондрий и эндоплазматического ретикулума ЭР . Метгемоглобин обладает низким сродством к 0, поэтому комплекс метгемоглобин0 неустойчив и легко разваливается, выделяя в кровь 0 2. Оксигемоглобин не вступает в реакцию с нитритами, поскольку связанный на геме кислород препятствует допированию электронов. Несмотря на высокую скорость реакции 1. ИОсинтаз не происходит значимой компенсации недостатка 0. Реутовым В. П с сотр. ЭТЦ цепи митохондрий .