Механизмы фотохимических реакций нитрозильных комплексов гем-содержащих белков индуцированных, низко-интенсивным лазерным излучением

• Автор: Борисенко, Григорий Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I Химические свойства и биологическая роль

1 Эндотелиальный фактор., расслабляющий гладкую мускулатуру сосудов.

2.Физикохимические свойства окиси азота.

3. Ферментативное и неферментативное образование 0 ю у1уо.

4. Промежуточные эквиваленты окиси азота в биологических средах

5. Реакции 0 с биологическими мишенями

6. Участие 0 в патофизиологических процессах

II. Взаимодействие гемсодержащих белков с окисью азота

1. Общие принципы

. Электронная конфигурация 0 и железа
Б. Особенности взаимодействия 0 и гемсодержащих протеинов
. Нитрозильные комплексы гема.
2. Взаимодействие 0 с гемоглобином
А. Реакции с участием гемоглобина и 0.
Б. ЭПРсигнал нитрозильных комплексов гемоглобина
3. Взаимодействие 0 с цитохромом с
III Фотохимические реакции гемовых протеинов, связанных с лигандами
1. Явление фотодиссоциации комплексов гемсодержащих протеинов.
2. Механизмы фотодиссоциации.
3. Конформационные переходы гема при фотодиссоциации.
4. Проблема соотношения фотофизики и фотохимии.
IV. Биологические эффекты излучений видимого диапазона.
1. Расслабление гладкой мускулатуры сосудов под действием света
2. Фотореактивация ферментов электронтранспортной цепи митохондрий. .
. Явление ингибирования дыхания окисью азота
Б. Механизм ингибирования цитохром с оксидазы и е фотореактивация
. Механизм ингибирования комплекса I и его фотореактивация
Г. Цитохром с роль в ингибировании дыхания и возможное участие в фотореактивации.
3. Фотобиологические основы терапевтического действия видимых излучений. .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
I. Материалы
1. Химические реактивы
2. Получение эритроцитов
3. Приготовление гемоглобина
4. Получение 0 .
5. Синтез нитрозильных комплексов.
. Приготовление нитрозильных комплексов гемоглобина
Б. Приготовление нитрозильных комплексов цитохрома с
. Нитрозилирование эритроцитарного гемоглобина.
II. Методы
1. Запись оптических спектров поглощения
2. ЭПРспектроскопия
А. Запись спектров нитрозильных комплексов
Б. Измерение концентрации
3. Методическое описание фотохимических экспериментов.
4. Программное обеспечение
5. Статистическая обработка.
Приложение А
Приложение Б
1. Описание и принципы функционирования автоматизированной системы ЭПРспектроскопии.
2. Оценка точности аналогоцифровых преобразований в системе
3. Оценка достоверности количественных параметров ЭПР сигнала.
РЕЗУЛЬТАТЫ
I. ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ НИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ГЕМОГЛОБИНА.
1. Спектр ЭПР нитрозильных комплексов гемоглобина.
А Спектры ЭПР различных форм нитрозильных комплексов гемоглобина. Б. Калибровка ЭПР сигнала НЬКЮ по оптическим и ЭПР спектрам.
2. Исследование фотолиза нитрозильных комплексов гемоглобина при облучении НеСс и НеЫе лазерными источниками
А. Исследование влияния облучения на нитрозильные комплексы гемоглобина при температуре жидкого азота.
Б. Исследование фотохимических реакций нитрозильных комплексов
гемоглобина при С в присутствии кислорода
В. Фотохимические реакции НЫМО в отсутствии кислорода
3. Обнаружение окиси азота, образующейся при облучении НЫМО
4. Эффект НеСс1 лазерного излучения на Энитрозотиолы и возможность образования 0 гемоглобина.
5. Влияние лазерного излучения на цельные и гемолизированные эритроциты обработанные окисью азота
. Методические трудности при работе с эритроцитами
Б. ЭПР спектроскопия НЫМО при комнатной температуре
. Фотодиссоциация нитрозильных комплексов очищенного гемоглобина Г. Фотодиссоциация нитрозильных комплексов эритроцитарного
гемоглобина
Д. Окисление очищенного и эритроцитарного НЫМО под действием
лазерного излучения
Е. Влияние глутатиона на фотохимические реакции НЫМО.
Ж. Обнаружение свободной окиси азота при облучении эритроцитарного
3. Фотоактивация нитритредуктазной активности НЬ
II. ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ НИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИТОХРОМА С
1. Оптический спектр и спектр ЭПР нитрозильных комплексов цитохрома с. .
2. Фотохимические реакции нитрозилированного цитохрома с.
ОБСУЖДЕНИЕ
. Фотохимические реакции нитрозильных комплексов гемоглобина.
II. Фотохимические реакции нитрозильных комплексов цитохрома с
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Но гемоглобин весьма хорошо связывается с 0 и может выполнять транспортную функцию по отношению к этой молекуле, то есть может выступать в роли переносчика 0 от мест образования к мишеням. Так или иначе, очевидно, что нитрозильные комплексы гемсодержащих белков являются интермедиатами биологических эффектов 0. Вернмся к свету. Известно, что излучения видимого диапазона вызывают биологические эффекты не только в автотрофных, но и в гетеротрофных организмах. Акцепторы излучения и механизмы его действия в автотрофных организмах например, в случае фотосинтеза или фототропизма более или менее известны. Но совершенно иначе обстоит дело с гетеротрофами. Показано также, что све усиливает потребление кислорода митохондриями, синтез АТФ и рост клеток, но существуют лишь гипотезы о механизмах этого явления. Однако, обращает на себя внимание тот факт, что свет влияет на те же биологические процессы расслабление гладкой мускулатуры и активность клеточного дыхания, в регуляции которых участвуют светочувствительные нитрозильные комплексы. Закономерно поставить вопрос, а не могут ли нитрозильные комплексы быть тем самым первичным акцептором излучения, через который реализуются биологические эффекты видимого света Не может ли быть так, что нитрозильные комплексы играют две роли участвуют в механизме биологического действия 0 и участвуют в механизме фотобиологических эффектов Возможно, действие света на живой организм и действие окиси азота связаны между собой через нитрозильные комплексы и именно поэтому наблюдается некоторая общность в эффектах видимого света и 0. Рис. Гйпотеза возможного механизма биологического действия видимого излучения. В году Ю. НЫМО. Предполагается, что под действием света комплексы НЬЫО распадаются с образованием свободной 0, которая, в свою очередь, вызывает дилатацию сосудов. В основу этой гипотезы легли следующие факты первое, НЫО образуется в физиологических условиях второе, видимый свет вызывает фотолиз комплекса гемЫО третье, распад различных доноров 0 в кровотоке оказывает значительный эффект на тонус сосудистой стенки. В этой логической цепочке не хватает одного существенного факта ни в одной работе не было показано, что при фотолизе НЬМО образуется свободная 0. Поэтому целью данного исследования стало изучение возможности освобождения окиси азота из НЬЫО под действием видимого излучения, а вместе с тем и изучение кинетики и дозовых зависимостей фотолиза НЬМО. Разумеется, обе задачи предполагают изучение фотолиза НЬМО как в растворе, так и непосредственно в эритроцитах. Не менее интересной представляется гипотеза о том, что фотоактивация дыхания реализуется через фотолиз нитрозильных комплексов митохондриальных белков. Как уже было сказано выше, 0 образует комплексы с гемсодержащими белками транспортной цепи электронов и, тем самым, блокирует их пеоенос Митохондрии эукариотических клеток обладают своей собственной 0синтазой. Повышение активности этого фермента сопровождается понижением митохондриального дыхания. Таким образом, может осуществляться аутокринный контроль дыхания. Возможен и паракринный контроль, который действительно имеет место, когда индуцибельная МОсинтаза активированных макрофагов синтезирует высокий уровень 0, достаточный для подавления дыхания ближайших клеток. Видимый свет повышает активность дыхания. Одним из возможных механизмов этого явления является фотолиз нитрозильных комплексов белков митохондриальной цепи и. Один из таких белков цитохром с. Литературные данные о действии света на его комплексы с 0 крайне скудны, поэтому задача изучения фотохимических реакций нитрозильных комплексов цитохрома с су1 с2Ы0 и су1 с3ЫО2 представляется не менее актуальной, чем изучение комплексов гемоглобина. В современной научной литературе время от времени появляется справедливая критика, касающаяся использования обозначений типа су1 с2 или йетеРе. Знак используется для обозначения заряда атома, имеющего ионные связи, в то время как гемовое железо находится в координационном комплексе и не имеет какоголибо заряда . Для обозначения валентности железа следует применять обозначения типа суГ с.