Применение лазерной сканирующей микроспектрометрии для решения задач аналитической цитометрии

• Автор: Шаронов, Георгий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Развитие микроспектрометрии

1.2. Применение микроспектрометрии

1.2.1. Изучение спектральных свойств витальных флуоресцентных зондов

1.2.2. Исследование противоопухолевых препаратов

1.2.3. Анализ собственной клеточной флуоресценции.

1.2.4. Регистрация резонансного переноса энергии флуоресценции

1.2.5. Многоцветный анализ

1.3. Возможности применения микроспсктрометрии в аналитической цитометрии
1.3.1. Цитомика.
1.3.2. Анализ плотных тканей
1.3.3. Флуоресцентный гибридизационный анализ.
1.3.4. Многопараметрическое иммунофенотипирование.
1.4. Методы аналитической цитометрии
1.4.1. Проточная цитометрия.
1.4.2. Цитометрия изображений.
1.4.3. Лазерная сканирующая цитометрия
1.4.4. Микроскопия с использованием ратиометрических красителей.
1.4.5. Микроскопическое измерение времени жизни флуоресценции.
1.4.6. Флуоресцентная микроскопия в ближней инфракрасной области
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Химические соединения и реагенты.
2.1.1. Циклоимидные производные хлорина рб и бактериохлорипа р
2.1.2. Цитохром с, его флуоресцентный аналог и мутантные варианты.
2.1.3. Цитотоксины из яда кобр
2.2. Регистрация активных форм кислорода и измерение фотостабильности ЦИХЛ и ЦИЬХЛ.
2.3. Работа с клетками и срезами тканей.
2.3.1. Инкубация с фотосенсибилизаторами
2.3.2. Идентификация клеточных органелл, внутриклеточного и активности протеаз.
2.3.3. Облучение клеток с фотосенсибилизатором.
2.3.4. Определение апоптоза и цитотоксичности
2.3.5. Электропорация
2.3.6. Изучение механизма клеточного транспорта ЦТ.
2.3.7. Подготовка образцов для микроскопии.
2.3.8. Изучениее механизма действия цитотоксинов в реальном времени
2.3.9. Срезы тканей мышей
2.4. Флуоресцентная микроскопия и цитометрия.
2.4.1. Определение цитотоксичности.
2.4.2. Определение апоптотического индекса.
2.4.3. Микроспектрометрия
2.4.4. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.
2.4.5. Количественные измерения с помощью микроскопа i ОМЕТА
2.4.6. Микроспектроцитометрия
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Применение МСЦдля измерения внутриклеточной концентрации и идентификации молекулярных взаимодействий фотосснсибилизаторов.
3.1.1. Моделирование внутриклеточных взаимодействий фотосенсибилизаторов в растворах
3.1.2. Анализ взаимодействий и расчет концентрации фотосенсибилизаторов внутри клеток.
3.2. Изучение структурнофункциональных связей ЦИХЛ и ЦИБХЛ
3.2.1. Изучение способности генерации активных форм кислорода ЦИХЛ и ЦИБХЛ.в
3.2.2. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ и ЦИБХЛ
3.2.3. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ и ЦИБХЛ
3.2.4. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИБХЛ.
3.2.5. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р8.
3.3. Применение МСЦ для выявления апоптоза и его связи с активностью митохондрий после фогоиндуцированного воздействия
3.4. Изучение цитохром синдуцированного апоптоза
3.4.1. Активация апоптоза в метках I3 экзогенным цитохромом с
3.4.2. Регистрация цитохрома с внутри клеток.
3.4.3. Изучение активности и роли митохондрий в цитохром синдуцированном апоптозе.
3.4.4. Изучение проапоптотической функции мутантных форм цитохрома с
3.5. Анализ мишеней воздействия иммуномодулятора полиоксидония на клетки периферической крови человека.
3.5.1. Изучение взаимодействия полиоксидония с лейкоцитами крови
3.5.2. Локализация полиоксидония в клетках фагоцитарного ряда.
3.6. Применение МСЦ для изучения механизма действия цитотоксинов из яда кобр
3.6.1. Измерение цитотоксичности ЦТ в отношении опухолевых клеток и лейкоцитов крови.
3.6.2. Локализация ЦТ в клетках Н1 и А
3.6.3. Изучение механизма интернализации ЦТ2Ыо
3.6.4. Анализ локализации ЦТ2Ио и состояния клеточных структур при цитотоксических дозах.
3.6.5. Эффекты субцитотоксических доз цитотоксинов.
3.6.6. Предполагаемый механизм действия цитотоксинов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Основные принципы перечисленных методик были предложены в середине XX века, однако широкое применение в практике они нашли лишь в последние лет. Причинами этого являются технические сложности реализации, ограниченный выбор флуорофоров и наличие периода апробации метода. Одним из способов значительно увеличить информативность оптической микроскопии и открыть новые возможности метода является применение в микроскопии спектрального анализа. Достоверная регистрация отдельных флуорофоров, одновременное использование большого количества флуорофоров, точное определение содержания каждого флуорофора в каждой точке образца и измерение спектральных характеристик флуоресценции это, несомненно, одни из основных задач, определяющих развитие новых методов оптической микроскопии. Микроспектрометрия это еще один способ решения этих задач, который не заменяет другие современные методы флуоресцентной микроскопии, такие как и , а придает им дополнительную точность и информативность. Микроспектрометрия позволяет использовать практически весь спектр существующих сегодня флуорофоров. Микроспектрометрия, однако, пока редко применяется в биологических исследованиях. Причиной этого, как и в случае других методов на стадии развития, служат сложность технической реализации метода, что выражается в трудоемкости и невысокой скорости измерений, и ограниченное число работ, в которых ярко продемонстрированы преимущества использования метода. До настоящего времени большинство м икроспектральных измерений проводилось на единичных клетках, что было обусловлено невысокой скоростью анализа. Возможности метода в этих исследованиях были реализованы не полностью. Микроспектрометрия может быть использована для решения задач цитометрии измерения физикохимических параметров отдельных клеток и статистического анализа этих параметров на выборке клеток. Число задач, в которых требуется анализ выборки клеток, велико, что способствовало появлению в х годах XX века метода проточной цитометрии ПЦ, основанного на анализе клеток в потоке. Эти ограничения стимулировали внедрение в широкую практику в конце х годов прошлого столетия метода лазерной сканирующей цитометрии ЛСЦ, основанного на лазерной сканирующей микроскопии. Поскольку микроспектрометрия обладает большей информативностью и точностью количественного анализа по сравнению с традиционной и лазерной сканирующей микроскопией, то применение микроспсктрометрии в цитомстрии вызывает растущий интерес со стороны исследователей. Настоящая работа выполнялась в период с по год в лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Лаборатория располагает микроспектррафом фирмы i, предназначенным для измерения комбинационного рассеяния, модифицированным для измерения флуоресценции при непосредственном участии автора. С года в лаборатории появилась возможность использовать лазерный сканирующий конфокальный микроскоп i ОМЕТА. Часть исследований проводилась с использованием флуоресцентного микросиектрографа французской фирмы i в сотрудничестве с Лабораторией молекулярной биофизики Центра научных исследований Франции Орлеан, Франция. В ходе совместных работ с лабораториями ИБХ РАН и другими институтами, возникали задачи исследования взаимодействия новых классов соединений, обладающих разнообразной активностью, с клетками. В связи с этим особенно остро стоял вопрос разработки универсального, надежного и информативного цитометрического метода. В качестве основы такого метода была предложена флуоресцентная микроскопия, комбинированная со спектральным анализом, и были сформулированы основная цель и задачи данной работы. Целью работы является разработка на основе микроспектрометрии метода, применимого для решения широкого спектра задач аналитической цитометрии. Метод должен позволять измерять физикохимические параметры отдельных клеток с помощью флуоресцентных зондов, изучать накопление и локализацию флуоресцентных и флуоресцентномеченных БАС в отдельных клетках и выявлять особенности распределения этих параметров в популяции клеток. Разрабатываемый метод был назван микроспектроцитометрией МСЦ.