Исследование мембранных тубулярных структур в модельных и клеточных системах

• Автор: Лизунов, Владимир Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

1.1. Квазицилиндрические поверхности

1.2. Мембранные тубулярные структуры в биологических системах 1.3. Эндоцитоз

1.4. Экзодитоз в адипозных жировых клетках 1.5. Транспортные свойства тубулярных структур 1.6. Модельные системы для исследования тубулярных структур 1.7. Тубулярные структуры из БЛМ мембранная трубка

1.8. Энергетика и механизмы формирования клеточных тубулярных структур

Глава 2. Материалы и методы 2.1. Реактивы

2.2. Формирование бислойных липидных мембран 2.3. Липидный состав мембран

2.4. Формирование мембранной трубкинанотрубки из БЛМ 2.5. Флуоресцентная видеомикроскопия МТ и НТ 2.6. Флуоресцентная видеомикроскопия переноса микрообъектов через НТ
2.7. Измерение электрической проводимости МТ и НТ 2.8. Измерение электрической проводимости мембраны МТНТ 2.9. Численное нахождение формы, энергии и критических параметров МТ
2 Сопоставление формы МТ с катеноидом 2 Определение радиуса, энергии и критических параметров НТ 2 Компьютерное моделирование формы МТНТ в среде vv

2 Клетки I мышиные макрофаги

2 Эндоцитоз флуоресцентных микросфер из микропипетки

2 Измерение адмитанса мембранного фрагмента
2 Адипозные жировые клетки
2 Конфокальная микроскопия адипозных клеток
2 Метод нарушенного полного внутреннего отражения нПВО
2 Обработка и анализ изображений
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Изменение формы МТ при растяжении и коллапсе
3.2. Проводимость МТ
3.3. Описание МТ моделью несимметричного катеноида 3.4. Квазицилиндрическая мембранная нанотрубка 3.5. Проводимость НТ
3.6. Кусочнонепрерывное описание формы НТ 3.7. Изменение проводимости ТС при переходе МТНТ 3.8. Бистабильность ТС бифуркационные переходы МТНТ 3.9. ТС при эндоцитозе мембранные перешейки
3 ТС при экзоцитозе 4 содержащих везикул
Основные результаты и выводы
Приложение
Литература


Для создания биореакторов и моделирования клеточных биохимических процессов необходима разработка методов формирования систем взаимосвязанных компартментов ,. Однако до сих пор остаются малоисследованными свойства простейших мембранных трубочек. Исследования мембранных тубулярных структур, существующих в клетках, существенно затруднены многокомпонентностыо и сложностью системы, присутствием огромного количества белков и других веществ, активно взаимодействующих с мембраной. Поэтому приоритетным направлением является создание модельных систем, позволяющих исследовать мембранные ТС в отсутствии клеточных факторов. Существующие на данный момент методики формирования мембранных трубочек обладают существенными ограничениями и недостатками. Так модельные системы, основанные на липосомах, ограничены использованием растворов с очень малой ионной силой ,. Искусственные гигантские липосомы оказываются не стабильными при физиологических условиях и, следовательно, не позволяют изучать взаимодействия мембраны с клеточными белками. Мембранные тубулярные структуры, выделяемые из клеток, содержат большое количество примесей и обладают неконтролируемым липидным составом. Более того, все известные на данный момент модельные системы не позволяют напрямую исследовать их транспортные свойства, измерять проницаемость и исследовать влияние механических свойств липидного матрикса на свойства ТС. В данной работе было проведено исследование мембранных тубулярных структур в модельных и клеточных системах. В модельной системе была разработана оригинальная методика формирования ТС из БЛМ, позволяющая воспроизводимо формировать как микроскопические мембранные трубки МТ, так и нанотрубки НТ с радиусом до нескольких нанометров. Сочетание электрических измерений с флуоресцентной видеомикроскопией позволяло регистрировать форму МТ и одновременно исследовать динамику проводимости в процессе коллапса и перехода в НТ. На клеточной системе были осуществлены исследования ТС, формируемых при эндо и экзоцитозе т. МП. На линии перитонеальных макрофагов I была исследована динамика проницаемости МП в процессе эндоцитоза, и, в частности, при фагоцитозе полистереновых микросфер. Регистрация событий эндоцитоза осуществлялась на малых участках клеточных мембран в условиях регистрации тока в режиме фиксации потенциалов метод , конфигурация , в сочетании с техникой определения адмиттанса ,,. На адипозных жировых клетках была исследована латеральная проницаемость МП, формируемых при слиянии специальных везикул, содержащих мембранный белок 4 9,. Была использована флуоресцентная микроскопия в сочетании с методикой нарушенного полного внутреннего отражения 2,0. Квазицилиндрические поверхности. В общем случае тубулярная структура представляет собой поверхность с цилиндрической топологией или т. Впервые подобные поверхности были описаны задолго до начала исследований мембранных ТС ,,. Структуры, имеющие данную топологию, возникают в самых разнообразных системах тонкие пленки, эмульсии, пены, капли жидкости 1,7,. Необходимым условием является наличие в системе нескольких несмешивающихся фаз и натяжения на границе. Перешейки могут образовываться при разделении одной из фаз на пространственно не связанные объемы . Это происходит при отрыве капли, при делении пузырьков и мыльных пленок 1,8. Несмотря на разнообразие этих процессов, во всех случаях формирование перешейка и его деление определяется поверхностными силами, в частности, межфазным поверхностным натяжением 1,. Особое внимание исследователей привлекали процессы потери устойчивости, или процессы деления перешейков. Форма перешейка и основные стадии деления были впервые исследованы в классических экспериментах с мыльными пленками и водными перешейками ,. Опишем вкратце эксперименты с мыльной пленкой. Было показано, что при расстоянии между кольцами, не превышающем критической длины Ьк, мыльная пленка имела форму катеноида. Рис. Деление макроскопической квазицилиндрической мыльной пленки. Видеокадры отражают трансформацию поверхности при коллапсе. Отсчет времени идет с момента начала коллапса. Диаметр колец равен ,см. Р.Н.