Клеточная модель нейрофибриллярной патологии болезни Альцгеймера и FTDP-17 на основе мутантных форм белка tau

• Автор: Хлистунова, Инна Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 99 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА

1.2 ФРОН ГОТЕМПОРЛЛЫ1ЫЕ ДЕМЕНЦИИ И ПАРКИНСОНИЗМ.

СВЯЗАННЫЕ С ХРОМОСОМОЙ .

1.3 ГИПОТЕЗЫ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

И ФРОНТОТЕМПОРАЛЬНЫХ ДЕМЕНЦИЯХ. СВЯЗАННЫХ С ХРОМОСОМОЙ .

1.4 АССОЦИИРОВАННЫЙ С МИКРОТРУБОЧКАМИ БЕЛОК

1.4.1 Белки, ассоциированные с микротрубочками.

1.4.2 Структура белка

1.4.3 Функции белка

1.5 ОБРАЗОВАНИЕ АГРЕГАТОВ БЕЛКА .
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
3.1.1 Культивирование бактерий.
3.1.2 Приготовление электрокомпетентных клеток.
3.1.3 Трансформация компетентных клеток
3.2 МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
3.2.1 Выделение плазмидной ДНК.
3.2.1.1 Минипреп.
3.2.1.2 Максицреп
3.2.2 Выделение геномной ДНК из ткани хвоста мыши
3.2.3 Определение концентрации ДНК.
3.2.4 Гельэлектрофорез ДНК
3.2.5 Модификация ДНК
3.2.5.1 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
3.2.5.2 Дефосфорилирование ДНК С1Рфосфатазой.
3.2.5.3 Амплифицнрованис ДНК в полимеразной
цепной реакции
3.2.5.4 ТОРОклонировагие
3.2.5.5 Выделение ДНК из агарозных гелей
3.2.5.6 Лигирование.
3.2.6 Секвенированис ДНК.
3.3 культуры клеток.
3.3.1 Клеточные линии
3.3.2 Питательные среды и пассажирование клеток
3.3.3 Замораживание и опаивание клегок.
3.3.4 Подсчет клеток в гемоцитометре.
3.3.5 Выделение и культивирование клеток
мышиных нейронов.
3.3.6 Выделение и культивирование клеток
мышиных фибробластов.
3.3.7 Стабильная трансфекция клеток с помощью ООТАР
3.3.8 Иммунофлуоресценция
3.3.9 Тест на люциферазу.
3.4 БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
3.4.1 Определение концентрации белка по Брэдфорд.
3.4.2 Приготовление клеточных лизатов
3.4.3 Экстракция белка по методу Дэвиса
3.4.4 Электрофоретическое разделение белков
в полиакриламидном геле.
3.4.5 Окрашивание гелей i ii
3.4.6 Вестерн блот
3.4.7 Иммунное окрашивание и негативное контрастирование протеинов.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1 КЛОНИРОВАНИЕ.
4.2 СТАБИЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ К. КДК0, КАК0Ч7РР
В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ МЫШИ.
4.2.1 Экспрессия К и мутантов в клетках.
4.2.2 Зависимость экспрессии гена
от концентрации доксициклина
4.2.3 Агрегация .
4.2.4 Электронная микроскопия.
4.2.5 Окрашивание высокомолекулярных агрегатов
с помощью тиофлавина
4.2.6 Ингибирование индукции путем удаления доксициклина
из культуральной среды
4.3 СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ.
4.4 ПЕРВИЧНЫЕ НЕЙРОННЫЕ КУЛЬТУРЫ
4.5 ВЫЯВЛЕНИЕ САРКОЗИЛНЕРАСТВОРИМЫХ I РЕГАТОВ I VIV
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
6. ВЫВОДЫ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список принятых сокращений
АВ Вамилоид пептид
АРР предшественник амилоидного пептида
фронпогемпоральные деменции и паркинсонизм, связа1шые с хромосомой .
3 i ЗВ
бактериальная штательная среда ii.
белки, ассоциированные с микротрубочками МТ микротрубочки
i i i нейрофибриллярные сплетения, состоящие из парных спиралеобразных филаментов агрегированного белка .
регион область трех или четырех одинаковых последовательное гей из аминокислот в домене белка, связывающемся с микротрубочками.
додецилсульфаг натрия
Введение


ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ФРОН ГОТЕМПОРЛЛЫ1ЫЕ ДЕМЕНЦИИ И ПАРКИНСОНИЗМ. СВЯЗАННЫЕ С ХРОМОСОМОЙ . И ФРОНТОТЕМПОРАЛЬНЫХ ДЕМЕНЦИЯХ. СВЯЗАННЫХ С ХРОМОСОМОЙ . Белки, ассоциированные с микротрубочками. ОБРАЗОВАНИЕ АГРЕГАТОВ БЕЛКА . МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Культивирование бактерий. Приготовление электрокомпетентных клеток. МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Выделение плазмидной ДНК. Минипреп. Определение концентрации ДНК. Дефосфорилирование ДНК С1Рфосфатазой. Лигирование. Секвенированис ДНК. Замораживание и опаивание клегок. Подсчет клеток в гемоцитометре. Тест на люциферазу. Определение концентрации белка по Брэдфорд. Иммунное окрашивание и негативное контрастирование протеинов. РЕЗУЛЬТАТЫ. КЛОНИРОВАНИЕ. СТАБИЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ К. В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ МЫШИ. Экспрессия К и мутантов в клетках. Агрегация . Электронная микроскопия. СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. ВЫВОДЫ. Болезнь Альцгеймера является одним из самых распространенных дегенеративных заболеваний нервной системы. Па клеточном уровне для этой болезни характерны нейрофибриллярные сплетения, состоящие из спиралеобразных филаментов белка . Аналогичные нейрофибриллярные структуры наблюдаются при группе заболеваний, объединенных под общим названием фронтотемпоральные деменции и паркинсонизм, связанные с хромосомой . Была установлена однозначная корреляция образования этих структур со степенью развития деменции и показано, что их накопление приводит к гибели нейронов. На сегодняшний день описано лишь небольшое количество работ по созданию клеточных моделей для изучения молекулярных механизмов нейрофибршшярной патологии. Ни одна из предложенных моделей на основе полноразмерного белка не была адекватна, поскольку в них присутствовали лишь отдельные филамеиты при
отсутствии характерных нейрофибриллярных сплетений. Новизна нашего подхода при создании клеточной модели заключалась в использовании конструктов, содержащих только регион , поскольку из литературных данных известно, что этот участок является центральным ядром патологических нейрофибриллярных сплетений. Для получения клеточной модели были использованы охарактеризованные в нашей лаборатории конструкты, приводящие к образованию филамешов i vi. В году немецкий врач Алоиз Альцгеймер описал нейропатологические симптомы деменции, которая впоследствии была названа его именем 1. Нолсзтгь Альцгеймера является наиболее частой причиной старческих деменций и поражает примерно населения старше лет 2. В мире насчитывается примерно миллионов людей, пораженных болезнью Альцгеймера, и в связи с увеличением ожидаемой продолжительности жизни число больных за несколько десятков лет может увеличиться в 3 раза . В ходе болезни происходит усугубление когнитивного дефицита потеря абстрактного мышления, афазия нарушение речевой функции, анраксия нарушение двигательной активности, несмотря на ненарушенные моторные функции, агнозия невозможность распознавать или идентифицировать объекгы, несмотря на сохраненное сенсорное восприятие, дезориентирование во времени и в пространстве . Болезнь длится около лет. Симптомы болезни нарастают постепенно, клиническая фаза составляет последнюю треть общей продолжительности болезни 5. Выраженность симптомов обьяснястся прогрессирующим отмиранием нервных клеток, что приводит к уменьшению массы мозга рис. Наиболее выражено отмирание клеток в трансэнториналыюй области медиальной и темпоральной долей с последующим распространением вдоль гиппокампа и нсокортекса .