Исследование ДНК-актиномициновых комплексов при низких концентрациях методами флуоресцентной спектроскопии

• Автор: Ковалев, Александр Эдуардович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 136 с.

Содержание

Принятые сокращения.

Введение

Обзор литературы

1.1 Историческая справка

1.2 Общая характеристика акгиномицинов

1.3 Структура комплекса АМД ДИК.

1.4 Специфика взаимодействия АМД с ДИК

1.5 Энергетика взаимодействия АМД с ДНК.

1.6 Кинетика взаимодействия АМД и ДНК.

1.7 Выражение КамлстаТафта Линейное соотношстшс энергии сольватации.

1.8 Время жизни и поляризация флуоресценции. Уравнение Левшина Перрена.
1.9 Флуоримстрия в остановленном потоке
1. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
1. Уравнение Фредгольма первого рода
1. Уравнение гетерогенной адсорбции Фрейндлиха
Материалы и методы
2.1 Используемые реактивы.
2.2 Регистрация спектров флуоресценции 7аАМД и его комплексов
с ДНК, измерение поляризации и времени жизни флуоресценции
2.3 Корреляционный анализ.
2.4 Флуориметрия в остановленном потоке.
2.5 Поиск оптимального алгоритма обработки КФ и их последующий анализ
2.6 Поиск оптимальной по энергии структуры 7аАМД при помощи молекулярной динамики.
2.7 Измерения на установке .
2.8 Уравнение гетерогенной абсорбции Фрейндлиха.
2.9 Устранение влияния сорбциидесорбции 7аАМД на ход эксперимента .
Результаты и обсуждение.
3.1 Характеристика акгиномицина и его комплексов с ДНК в тяжелой
и обычной воде на основе спектральных данных
3.2 Молекулярная динамика комплекса 7аАМД с I1
3.3 Анализ сольватохромного эффекта 7аАМД.
3.4 Исследование кинетики взаимодействия 7аАМД и ДНК
3.5 Анализ корреляционных функций.
3.6 Измерение поляризации флуоресценции и ФКС на установке
Заключение.
Выводы.
Список опубликованных работ по теме диссертации.
Список цитируемой литературы


Охарактеризовать шпилечный олигонуклеотид и мицеллу как модели средств адресной доставки АМД, представляющие интерес в терапевтических целях. Совместить ФКС измерения с измерениями поляризации флуоресценции для обеспечения на порядок более высокой чувствительности ФКС к размеру флуоресцирующих частиц. Выполнить поиск и адаптацию алгоритма, позволяющего оценивать молекулярные параметры в эксперименте ФКС в присутствии фоновой флуоресценции для флуорофоров с низким квантовым выходом. Исследовать свойства неспецифической адсорбции 7аАМД, найти условия, позволяющие устранить влияние этой адсорбции в ходе эксперимента. Полученные экспериментальные данные определяют выбор адекватных молекулярных моделей взаимодействия ДНК противоопухолевое вещество в растворе, представляют ценную информацию для разработки лекарственных препаратов нового поколения. Литературный обзор условно можно разделить на две части. В первой части дается характеристика АМД. Во второй описываются теоретические основы и практические приложения используемых в работе методов. Еще в средние века было замечено, что трупы людей, болевших туберкулезом, после длительного пребывания в земле очищаются от инфекции. В г. Американская ассоциация но борьбе с туберкулезом поручила микробиологупочвоведу З. А. Ваксману выяснить причины быстрой гибели микобактерий туберкулеза после попадания их в почву. К этому времени он накопил богатый научный опыт относительно изучения почвенных грибов, актиномицетов. Им была создана научная группа, с сотрудниками которой он изучил около тысяч различных почвенных микроорганизмов в поисках антибиотиков, которые могли бы разрушать бактерии, не причиняя вреда человеку. Первые выделенные им антибиотики актиномицин и стрептотрицин оказались токсичными. Впервые актиномицин был выделен из культуральной жидкости герЮтусех апйЫоМсия. Из культуральной жидкости актиномицины могут быть выделены экстракцией бутиловым спиртом, ацетоном и другими растворителями. Актиномицины обладают антибиотическим действием против грамположительных бактерий и некоторых грибов. Известно более 0 актиномицинов, обозначаемых А, В, С, Д Р,Хи так далее. Молекулярная масса актиномицинов около дальтон. Актиномицин Д продукт жизнедеятельности герютусе5 раптШз, других актиномицетов. АМД относится к хромопептидам, то есть состоит из двух олигопептидных колец акриноцинилдиЪтреонил0валинилЬпролинилсаркозилМметилЬвалиниллактоном и феноксазинового цикла хромофорной группы, придающей ему оранжевокрасную окрашенность. Н в случае АМД и 2 для 7аАМД. Значительный интерес к актиномицину Д в биологии и медицине обусловлен использованием этого вещества в качестве противоопухолевого агента, антибиотика, средства для лечения СПИДа, препарата замедляющего старение. Это соединение ингибирует транскрипцию во многих системах, блокирует активность топоизомераз. АМД i vi связывается с одноцепочечными, гуанин содержащими участками ДНК, способными формировать шпилечные крестообразные структуры . . i, . При этом образуется стабильный комплекс, препятствующий продвижению полимераз по Д1 ПСматрице и, в конечном итоге, вызывающий их диссоциацию с ДНК. Высокая специфичность связывания АМД с ДНК и малая скорость диссоциации АМД из мест связывания объясняют эффективность блокирования актиномицином Д считывания полимеразами полинуклеиновых кислот. Связываясь с ДНК, АМД стабилизирует ее вторичную структуру повышает температуру ее плавления . , . Лекарственная форма АМД называется Дактиномицин или Космеген. АМД, не действуя на наиболее распространнные формы рака у человека, тем не менее, обладает высокой противоопухолевой активностью. Несмотря на то, что АМД был открыт в ых годах, он до сих пор применяется самостоятельно или, чаще, совместно с лучевой терапией, в сочетании с другими лекарственными средствами адриамицин, циклофосфан и другими для лечения злокачественной опухоли яичка, трофобластической болезни, различных сарком, в том числе у детей, лимфогранулематоза, множества других опухолей . Vi, .