Роль триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина

• Автор: Маликова, Наталья Петровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 92 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1. Роль триптофановых остатков в биолюминесценции

различных систем

1.1. Люцифераза светляков.

1.2. Бактериальная люцифераза

1.3. Фотопротеины

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Выделение и очистка белков

2.2. Биолюминесцентные свойства мутантных белков.

2.3. Реактивы.

Глава 3. Выделение, очистка и характеристика мутантных форм
фотопротеина обелина с заменами триптофановых остатков активного центра на фенилаланин
3.1. Выделение и очистка мутантных форм обелина
3.2. Активация апобелков синтетическим целентеразином
3.3. Основные люминесцентные свойства полученных мутантных форм
3.4. Влияние температуры на биолюминесцентную активность мутантных белков
3.5. Спектральные характеристики полученных мутантов
Глава 4. Выделение, очистка и свойства мутантных форм обелина
с заменой Тгр на другие аминокислотные остатки.
4.1. Выделение и очистка мутантных белков
4.2. Активация апобелков синтетическим целентеразином
4.3. Основные люминесцентные свойства полученных
мутантов.
4.4. Влияние температуры на биолюминесцентную активность мутантных форм обелина.
4.5. Спектральные характеристики полученных мутантов
Глава 5. Гипотеза о механизме формирования эмиттера в
биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Присоединение ионов кальция вызывает конформационные перестройки в белке, в результате которых практически мгновенно развивается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, продуктами которой являются целентерамид, СОг и квант света в голубой области. Гены нескольких фотопротеинов клонированы I , , Iiv , v , и получены рекомбинантные белки, свойства которых практически не отличаются от свойств природных белков. В г. i vii , и обелина из гидроидного полипа i ii i , . Было показано, что в обоих белках целентеразин и кислород локализованы нековалентными связями в виде пероксицелентеразина внутри гидрофобной полости белковой глобулы. Среди аминокислотных остатков, участвующих в локализации пероксицелентеразина в обоих белках находятся 4 триптофановых остатка, образующих сэндвичструктуры с ароматическими остатками молекулы целентеразина. Более детальных исследований этого вопроса как для акворина так и для обелина не проводилось. В лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН на протяжении нескольких лет ведутся работы по изучению биолюминесцентной системы одного из Са2регулируемых фотопротеинов обелина из гидроидного полипа i ii. Накоплены глубокие знания от определения нуклеотидной последовательности гена, кодирующего этот белок, до установления его третичной структуры Iiv , Iiv , v , i , . Показана перспективность использования обелина в различных аналитических системах Iiv , , , v , v , . В результате генноинженерных работ были сконструированы штаммыпродуценты мутантных белков с заменами триптофановых остатков активного центра молекулы обелина. Целью данной работы было изучение свойств этих мутантных белков и определение на основе полученных данных роли триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции Са2регулируемого фотопротеина обелина. Выделить в чистом виде мутантные формы рекомбинантного фотопротеина обелина, имеющие замены по триптофановым остаткам активного центра на фенилаланин, и мутантные формы, имеющие замены по му триптофановому остатку на гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту. Исследовать основные физикохимические свойства полученных мутантных форм рекомбинантного обелина. Выявить механизм формирования молекулыизлучателя на основе исследования влияния произведенных замен на биолюминесцентную функцию мутантных форм обелина. Оно связано со сдвигом равновесия между таутомерными формами эмиттера фенолятанионом Х 5нм и нейтральной формой Хт 0нм возбужденной молекулы целентерамида. Предложена гипотеза, Финальной стадией образования эмиттера биолюминесцентной реакции Са2регулируемых фотопротеинов является перенос протона от 6пгидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на , скорость которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца Тгр и 6пгидроксифенильной группой целентеразина. Все результаты данной работы получены впервые и перспективны для использования в фундаментальных и в прикладных исследованиях. Высокая скорость биолюминссцентного ответа и чувствительность к ионам Са2 в сочетании с разными спектральными характеристиками некоторых полученных мутантных белков позволяют использовать их в качестве датчиков для одновременного изучения кальциевых потоков в различных клеточных органеллах. Использование цветных мутантов обелина как меток в иммуноанализе перспективно для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 2, 9 и Красноярского Фонда Науки , а также программы РАН Физикохимическая биология. Материалы диссертационной работы докладывались на ХНм Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции Кэмбридж, Великобритания, и на семинаре лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН. По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.