Метод 1 Н ЯМР спектроскопии в исследовании экзометаболитов развивающихся микроорганизмов

• Автор: Юркевич, Дмитрий Иосифович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 201 с. : ил

Содержание
Введение

Г лава I. Обзор литературы

1. Применения ЯМРспектроскопии для исследования клеточного метаболизма

1.1. Энергетический метаболизм

1.2. Гликолиз и метаболизм углеводов

1.3. Цикл трикарбоновых кислот

1.4. Внутриклеточный рсдокспотенциал

1.5. Метаболизм аминокислот

1.6. Метаболизм жирных кислот и липидов

1.7. Вода. .

1.8. Одновалентные ионы.
1.9. Двухвалентные катионы
1 Ферментативные кинетики
1 Измерение внутриклеточного
2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Прогонный магнитный резонанс 1НЯМР
3. Особенности адаптации и культивирования микроорганизмов в Ц
3.1. Микроводоросли
3.2. Бактерии
3.3. Дрожжи.
3.4. Грибы
4. Общие положения о клеточных культурах и их культивировании
4.1. Г1ролиферация
4.2. Условия, необходимые для культивирования
4.3. Кривая роста и ее связь с метаболизмом
5. Медузомицег чайный гриб
5.1. Физические свойства и условия культивирования
5.2. Состав чайного гриба
5.3. Метаболизм чайного гриба
5.4. Антибактериальные свойства чайного гриба
Глава . Экспериментальная часть
1. Объекты и методы исследований .
1.1. Культивирование культур клеток фибробластов
1.2. Культивирование медузомицета
2. Техника ЯМР эксперимента
Глава III. Результаты и их обсуждение
1. Поиск корреляции между кривыми накопления метаболитов и кривой
роста клеток
1.1. Культивирование клеток на стеклянной поверхности
1.2. Культивирование клеток на поверхности пластмассы
1.3. Культивирование клеток в коллагеновом геле
2. Исследование методом НЯМР спектроскопии процессов роста и утилизации глюкозы медузомицетом
2.1. Культивирование медузомицета в средах на Н2О
2.2. Культивирование медузомицета в средах на ОгО
3. Идентификация частично дейтерированных экзометаболитов при культивировании медузомицета в тяжелой воде
3.1. Отнесение спектральных линий изотопомеров ацетата и этанола
3.2. Определение степени дейтеризации экзаметаболитов
4. Анализ путей включения изотопов Ни С в экзометаболиты в ходе утилизации глюкозы медузомицетом
4.1. Состав метальной группы.
4.2. Состав метиленовой группы
5. Идентификация минорных компонент экзаметаболитов медузомицета. Особенности 1 НЯМР спектров при некоторых замещениях С
и дейтерия
6. Влияние тяжелой воды на метаболизм симбиотического организма
6.1. Общая характеристика симбиотических отношений в медузомицете
6.2. Влияние включения дейтерия на ход обмена веществ
6.3. Особенности метаболизма симбиоза при адаптации
Заключение
Список литературы


Однако, ЯМР спектроскопия менее распространена, чем С ЯМР изза своей низкой чувствительности. Перспективными являются методики, позволяющие обнаружить связанный с азотом протон , . Теоретически, можно в 0 раз увеличить отношение сигналшум для изза более высокой чувствительности Н ядра , . К сожалению, метод применим только для протонов, которые медленно обмениваются со средой, что исключает большинство связанных с азотом протонов в физиологическом диапазоне . Аналогичный подход может применяться и для С. Так как связанные с углеродом протоны слабо обмениваются с Н2О, возможно применение экспериментов, детектирующих С по спектрам Н ЯМР , . В дополнение к увеличению чувствительности, упрощается сам эксперимент за счет более простых Н спектров. Хотя увеличение чувствительности для ЬС ЯМР несколько меньше чем для , , может быть достигнута значительная экономия времени и упрощение спектров, что делает эту методику довольно привлекательной. Большинство жирных кислот в клетках животных и растений необходимы для строительства мембран, жировых тел, и масляных капелек, являясь или структурным элементом клетки или концентрированным запасом энергии. Растворимые фосфолипиды и жирные кислоты могут изучаться i viv стандартными , , или Н ЯМР. Однако, изучение этих компонентов в мембранах требует специальных методов. Эфиры фосфорной кислоты в большинстве случаев дают один, перекрывающийся резонанс в i viv 3Р ЯМР спектрах, однако в некоторых типах клеток наблюдются различные пики для фосфолипидов. Моноэфиры фосфорной кислоты, типа фосфорилхолина или фосфорилэтаноламина можно наблюдать в Р ЯМР спектрах в диапазоне 2г4 . Эти пики перекрываются с пиками сахарных фосфатов и АМФНМФ, что делает их обнаружение довольно сложным i . Методом Р ЯМР и Н ЯМР изучались липопротеины разной плотности очень низкой V, низкой , высокой , и очень высокой V. Фосфолипиды состоят приблизительно на из фосфатиди л холила, на из сфингомиелина, и других эфиров фосфорной кислоты тана фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола. Разрешены пики сфингомиелина и фосфатидилхолина неповрежденых и , их отношения приблизительно 15 и 12, соответственно , . В спектрах Н ЯМР плазмы крови идентифицированны пики, представляющие СН2 и СНз группы V. , , . Лучшее разрешение между пиками было получено методом спинового эха И ЯМР, который различает подвижные СН2 и СН3 группы . С ЯМР можно использовать для характеристики масла и жиров. Моггт быть определены не только отношения между насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами, но также отношение между моно и полиненасыщсиными жирами. Вода составляет приблизительно от до содержимого клеток. В воде методом ЯМР можно наблюдать четыре изотопа Н, 2Н, 3Н, и 0. Наиболее широкое применение нашел Н ЯМР, хотя у него, как и у любого другого метода, есть свои достоинства и недостатки. Ясно, что если требуется определить концентрацию протонсодержащего мегаболита, большая величина сигнала воды ограничиваег предел обнаружения других соединений, поскольку он зависит от цифровой разрешающей способности или динамического диапазона спектрометра. Но существует много методов этой решения проблемы . Однако, легко обнаруживаемый резонанс воды можно использовать для определения относительных концентраций метаболитов, для отнесения химического сдвига и для оптимизации однородности магнитного поля биологических материалов. Так как количество воды в ткани можно определить довольно точно, отношение между сигналом воды Н ЯМР и пиком метаболита, типа АТФ Р ЯМР, может использоваться, чтобы вычислить абсолютную концентрацию ЯМРвидимого АТФ в образце. Но, чтобы определить коэффициент пропорциональности между двумя изотопами, требуется тщательная кашбровка , , . Частоту резонанса протонов воды можно использоваться и как В1гтренний этатон для измерения химического сдвига других ядер, например, Р, С, или ,.