Физико-химические свойства фибритина бактериофага Т4 и применение его карбоксиконцевого домена в белковой инженерии

• Автор: Сернова, Наталия Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Долгопрудный
• Количество страниц: 107 с. : 15 ил.

VII. Процесс укладки полипептидной цепи в биологически активную пространственную структуру белка фолдинг часто называют второй частью генетического кода ii, i, , i, Курочкина, Месянжинов, v, , . Известно, что определенные участки аминокислотной последовательности, и даже отдельные аминокислотные остатки, принципиально важны для начальных этапов формирования третичной структуры белка i, . В фолдинге многих белков участвуют шапероны, что впервые было обнаружено у вирусов бактерий, бактериофагов , . Поэтому очень часто экспрессия рекомбинантных белков в гетерологичном организме, в котором нет специфических шаперонов, приводит к формированию неспецифических агрегатов телец включения. Нарушения фолдинга белков, которые вызываются мутациями, являются причиной многих заболеваний человека, например, болезни Альцгеймера , , . Благодаря многократно повторяющейся структуре фибриллярные белки представляют удобную модель для изучения механизмов фолдинга. Известно, что карбоксильные домены нескольких фибриллярных белков обеспечивают постграисляционную олигомеризацию. Т4 , . В нашей лаборатории впервые решена кристаллографическая структура карбоксиконцевого домена фибритина фага Т4, названного фолдоном , . Продукт гена мае i i бактериофага Т4, или фибритин, это первый олигомерный белок, для которого определена и детально охарактеризована структурная единица, отвечающая за правильную укладку и сборку белка. Сконцевой домен белка, который пресгавляет из себя тримерный ii, инициирует параллельную сборку трех полипептидных цепей продукта гена в аспиральный i i фибритин , . Летаров, и , . Решение структуры ядра фолдинга1. Наличие фолдона инициирует правильное выравнивание слитых с ним полипептидов и последующую сборку трех субъединиц, что, повидимому, позволяет для некоторых белков обойти традиционный шаперонный путь фолдинга. Целью настоящей работы явился анализ доменной структуры и физикохимических свойств фибритина бактериофага Т4, а также создание химерных конструкций с использованием его Сконцевого домена фолдона. Проверить калориметрическими методами, предсказанную ранее трехдоменную структуру фибритина. Изучить свойства химерного белка и провести скрининг для получения его кристаллов с целью последующего определения его пространственной структуры. Научная новизна и практическая ценность. В данной работе впервые сконструирован набор делециониых мутантов продукта гена , которые наряду с ранее созданными, были использованы для анализа термодинамических свойств и доменной структуры фибритина с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии. Впервые получен ряд делециониых мутантов пг бактериофага Т4. Разработаны методы выделения и очистки этих белков. В ходе исследования разработана и экспериментально проверена стратегия использования ядра фолдинга фолдона фибритина для управления сворачиванием и олигомеризацией другого тримерного фибриллярного белка, повидимому, в обход шаперонного пути. Апробация работы. Материалы работы изложены в двух опубликованых статьях и главе книги. Результаты исследований доложены на конференциях Ii i ii , i, i, . Глава П. Суперспиральные белки i i структура, функции, механизмы олигомеризации, методы исследования. Механизмы, лежащие в основе правильной укладки полипептидной цепи, сходящей с рибосомы, в биологически активную молекулу белка до сих пор полностью не расшифрованы. Предсказать структуру белка на основе его последовательности удается сравнительно редко, в основном в случае наличия известных структур близких гомологов , . Мотив i i суперспнраль это первый, если не единственный мотив, позволяющий предсказать структуру белка, или его отдельного домена, на основе анализа последовательности аминокислот. Существование структуры i i была независимо предсказано в г. Френсисом Криком i, 1, а также Полингом и Кори i, , для ряда фибриллярных белков, но впоследствии было забыто на летний период. И только в конце х годов, когда обнаружили, что структура i i определяет свойства многих факторов транскрипции , .