Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков

• Автор: Басова, Лиана Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений и обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Ненативные состояния белков в живой клетке

1.2. Заряженная поверхность мембраны как денатурирующий агент i

1.3. Белки и мембраны. Возможные пути взаимодействия

1.4. Водноспиртовые смеси как модель влияния поля мембраны на структуру белков

1.5. Пространственная структура и функции миоглобина

1.6. Структура и свойства цитохрома Ь5

1.7. Краткая характеристика структуры алактальбумина.

1.8. Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Приготовление растворов
2.2. Методы исследования третичной структуры
2.2.1. Абсорбционная спектроскопия.
2.2.2. Флуоресцентная спектроскопия
2.2.3. Круговой дихроизм в ближней УФ области
2.2.4. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения.
2.2.5. Сканирующая микрокалориметрия.
2.3. Методы изучения вторичной структуры
2.3.1. Круговой дихроизм в дальней УФ области
2.4. Методы исследования взаимодействия белков с мембраной
2.4.1. Высокоэффективная жидкостная гельхроматография.
2.4.2. Макроскопическая диффузия .
2.4.3. Ограниченный протеолиз
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ МИОГЛОБИНА
3.1. Фосфолипидные везикулы вызывают нарушение третичной
структуры миоглобина.
3.2. Вторичная структура миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул сохраняется
3.3. Денатурация миоглобина, вызываемая фосфолипидными везикулами, приводит к взаимодействию белка с их поверхностью
3.4. Стабильность миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул
3.5. Фосфолипидные везикулы облегчают автоокисление оксимиоглобина.
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМОГО ФРАГМЕНТА
ЦИТОХРОМА Ь5
4.1. Особенности нарушения нативных взаимодействий в третичной структуре цитохрома Ь5 в присутствии фосфолипидных везикул
4.2. Сохранение вторичной структуры цитохрома Ъ в присутствии фосфолипидных везикул
4.3. Взаимодействие цитохрома Ь5 с фосфолипидными везикулами
4.4. Денатурирующее действие везикул из смеси фосфолипидов на цитохром Ьз эффективнее, чем из ненасыщенных отрицательно заряженных фосфолипидов
ГЛАВА 5. СОПОСТАВЛЕНИЕ КОНФОРМАЦИОННОГО
СОСТОЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ БЕЛКОВ В ПРИСУТСТВИИ ВЕЗИКУЛ И В ВОДНОСПИРТОВЫХ СМЕСЯХ
5.1. Конформационные изменения алактальбумина в присутствии фосфолипидных везикул
5.2. Сопоставление структурных особенностей различных белков в присутствии фосфолипидных везикул.
5.3. Сравнительная оценка конформационного состояния различных белков в присутствии фосфолипидных везикул и в водноспиртовых смесях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Во Введении представлено описание актуальности изучаемой проблемы и цели исследования, а также отражена научная новизна работы. Глава 1 посвящена описанию и анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований ненативных состояний белка в клетке и полученных в модельных системах. В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в данной работе. В главе 3 представлено экспериментальное исследование структурных свойств апо и холомиоглобинов в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 4 описано конформационное поведение водорастворимого фрагмента цитохрома в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 5 представлены структурные данные, полученные для человеческого алактальбумина, а также проводится сравнительное описание конформационного состояния различных белков в присутствии везикул и в водноспиртовых смесях. Цитируемой литературы в алфавитном порядке. Основные результаты данной диссертационной работы отражены в публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1. Существует много экспериментальных данных, согласно которым ряд клеточных процессов в клетке требует не жесткого нативного состояния белка, а некоторого ненативного, достаточно гибкого состояния, способного адаптироваться к различным условиям в клетке или быть компетентным к транслокации через мембраны, белокбелковым взаимодействиям, олигомеризации, связыванию или передаче лигандов см. v i, . Кроме этого, ненативные состояния белков в клетке могут быть вызваны возникновением мутаций, которые приводят к неправильному сворачиванию белка и в итоге к агрегации, что может быть причиной возникновения генетических заболеваний v i, . Ненативное промежуточное состояние белка, с одной стороны, сохраняет его общую архитектуру, а с другой допускает вращательную изомеризацию многих внутренних боковых цепей. Оно имеет более гидрофобную поверхность за счет дополнительного экспонирования части гидрофобных боковых групп. Молекула белка в подобном ненативном промежуточном состоянии наиболее изучено из них состояние расплавленной глобулы i, приобретает способность аккомодироваться как к полярному, так и к неполярному окружению. Это может позволить белкам в этом состоянии взаимодействовать с гидрофобными поверхностями гораздо легче, чем в нативном состоянии, что может объяснять повышенное сродство белка к мембранам при низких . Более того, состояние с менее полярной поверхностью может быть транслоцировано через мембрану со сравнительно небольшой свободной энергией активации. Эти наблюдения позволили Бычковой и др. v . А именно, состояние расплавленной глобулы не имеет жесткой третичной структуры, но при этом сохраняет гидрофобное ядро, компактно и содержит нативоподобную вторичную структуру v i, . Ее специфическим свойством является появление более гидрофобной поверхности по сравнению с нативным состоянием. Белки в состоянии расплавленной глобулы могут участвовать в транслокации через мембрану, оставаясь в состоянии, компетентном к транспорту подробнее пункт 1. Состояние расплавленной глобулы может возникать сразу после биосинтеза во вновь синтезированной полипептидной цепи и стабилизироваться шаперонами белкамипомощниками как обычный кинетический интермедиат в сворачивании белка, пока он не трансформируется в нативное состояние. Поскольку между этими двумя состояниями существует большой потенциальный барьер, то клетка может иметь несколько причин сохранять белок в состоянии расплавленной глобулы, предохраняя его от сворачивания в ненужное время или в ненужном месте, чтобы обеспечить правильный процесс сворачивания v i, . Экспериментально было показано, что шапероны не взаимодействуют с нативным белком, но узнают вновь синтезированную цепь v , . Например, после биосинтеза около белков . Vii , . Свойства белков дигидрофолатредуктазы ДГФР и роданезы, связанных с шаперонами, сходны со свойствами расплавленной глобулы этих белков в растворе i .