Новые подходы в изучении структурной и функциональной организации систем анионного транспорта в биологических мембранах

• Автор: Орлов, Юрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 197 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.

Список принятых сокращений.

Глава I Топография транспортных систем проксимальных канальцев почки и

структурная полярность эпителиальных клеток

Глава 2. Транспорт органических анионов в проксимальных канальцах почки.

2.1. Локализация

2.2. Специфичность

2.3. Этапы секреции органических анионов в почечных канальцах

2.3.1. Транспорт через базолатеральную мембрану.

2.3.2. Внутриклеточное распределение органических анионов.

2.3.3. Транспорт через апикальную мембрану
Глава 3. Выделение апикальной и базолатеральной мембран из клеток проксималь
ных канальцев и возможность изучения транспорта органических анионов на везикулярных структурах. .
Глава 4 Влияние фазового состояния липидного бислоя на функционирование
мембранных белков.
Г лава 5. Материалы и методы исследования транспорта органических анионов в
проксимальных канальцах почки.
5.1. Выделение везикулярных препаратов апикальной и базо латеральной мембраны из коры почки крысы
5.2. Определение активности маркерных ферментов.
5.3. Обсуждение метода выделения мембранных фракций.
5.4. Определение уровня накопления 3Нпаминогиппуровой кислоты
НПАГ в везикулярных мембранных препаратах
5.5. Выбор оптимальных условий фильтрации везикулярных мембранных препаратов
5.6. Метод введения ЭПР зонда в липидный бислой АМ и математическая обработка данных ЭР спектроскопии.
5.7. Электронная микроскопия фракции АМ.
Глава 6 Результаты исследования транспорта органических анионов с использова
нием везикулярных препаратов апикальной мембраны. Влияние фазового состояния липидного бислоя на транспортную кинетику.
Глава
Глава 8.
Глава 9.
6.1. Электронномикроскопический контроль фракции апикальной мембраны
6.2. Изучение транспорта органических анионов в везикулы ЛМ коры почки крысы
Обсуждение результатов исследования транспорта органических анионов через апикальную мембрану проксимальных канальцев почки крысы.
7 I. Общая характеристика накопления ПАГ в везикулах апикальной мембраны.
7.2. Влияние фазового состояния липидного бислоя АМ на кинетические
характеристики переносчика ПАГ и активность щелочной фосфатазы
Идентификация переносчиков органических анионов проксимальных канальцев почки.
8.1. Молекулярнобиологическое клонирование и метод аффинных меток.
8.2. Материалы и методы.
8.2.1. Синтез бромацетилированной паминогиппуровой кислоты.
8.2 2. Синтез диазогиппуровой кислоты.
8.2 3. Обработка мембранной фракции бромацетилированным паминогиппуратом.
8.2 4 Обработка мембранной фракции диазогиппуратом
8.2.5. Разделение белковой и липидной фракции перед электрофорезом и электрофорез
8 2 6. Выделение и анализ липидов.
8 3. Необратимое ингибирование транспорта ПАГ в везикулах апикальной
мембраны бромацетилированнымпаминогиппуратом ВгАсПАГ
8.4. Аффинная идентификация полипептидов системы транспорта органических анионов апикальной и базолатеральиой мембраны проксимальных
канальцев почки
Математическое моделирование транспортных потоков в биологических мембранах.1
9.1. Кинетика и механизм транспортной реакции. История развития
9.2. Основные черты транспортной реакции Современные представления
9.2.1. Классификация транспортных процессов
9.2.2 Вторичноактивный транспорт
9.3. Способы интерпретации транспортных векторных реакций
9.4 Противопоток.
9.5. Котранспорт.
Глава . Экспериментальные примеры функционального взаимодействия котранс
портных и анионобменных переносчиков
.1. Транспортная система обменного типа мочевая кислота урат анион.
.2. Транспортная система обменного типа монокарбоксилатОН
.3. формат переносчик обменного типа
.4. С1оксалат переносчик обменного типа.
.5. 0. переносчик обменного типа.
.6. независимый С Г НССЪ переносчик обменного типа
7. Анионообменные переносчики в других тканях.
Глава . Минимальная математическая модель энергетического сопряжения
котранспортного и анионобмен но го механизмов переноса в биологических мембранах.
.1. Исходные предположения и формулировка модели.
.2. Компьютерное моделирование кооперативной работы котранспортного и анионобменного переносчиков
3. Использование математической модели для описания экспериментальных результатов
Выводы.
Список литературы


По ферментному составу апикальная мембрана резко отличается от базолатералыюй в ней отсутствует , ГФаза и имеется в больших количествах щелочная фосфагаза, дисахаридаза, углутамилтранспептидаза, углутамилтрансфераза, аденилатциклаза , , , i, Бреслер, Никифоров, ii, . В обеих мембранах рис. НСОз, СГ, , Са2, фосфата, моно и дикарбоксилатов, а также переносчики, осуществляющие секрецию чужеродных органических анионов i, , . Как уже говорилось, система транспорта органических анионов почечных канальцев один из наиболее мощных защитных механизмов организма. Рис. Строение юкстамедуллярного А и суперфициалыюго Б нефронов почки. Генле 6 толстое восходящее колено петли нефрона 7 плотное пятно 8 дистальный извитой каналец 9 связующий отдел , собирательная трубка беллиниева трубка. Рис 1. Схема тонкого строения клеток проксимальных канальцев почки млекопитающих. I микроворсинки апикальной мембраны 2 пиноцитозные пузырьки 3 канальцы эндоплазматической сети 4 ядро 5 аппарат Гольджи 6 митохондрии 7 впячивания базальной мембраны 8 пальцевидные сцепления 9 лизосомы базальный слой плотный контакт между соседними клетками щель между латеральными мембранами соседних клеток. Альберт, Парк, i, , Берхин, Бреслер, Ьреслер, Никифоров, , i, , Казбеков и др. Поэтому понятен интерес исследователей к этой системе. Ее изучению посвящено огромное количество работ, результаты которых обобщены и проанализированы в ряде обзорных работ i, Форстер, i, Наточин, i, Верхин, Бреслер, Никифоров, , i, i, а i, i, i, v, . При изучении механизмов и энергетических источников транспорта различных веществ через мембраны эпителиальных клеток использовались разные методические подходы, равно как и разные объекты исследования. Среди них отметим эксперименты i i с использованием микроперфузии просвета проксимального канальца или периферийной кровяной капиллярной сети i, . Орлов и др. Исследования на везикулярных мембранных препаратах и на изолированных канальцах позволили разделить транспортные процессы, происходящие на разных сторонах эпителиальной клетки почечного нсфрона базолатератьной, контактирующей с сетью кровяных капилляров, и апикальной, обращенной в просвет канальца. Как показано на рис. ПАГ глугарат
Рис. Транспортные системы проксимальных канальцев почки. Л система реабсорбции Ыа, НСО, С Б система реабсорбции сахаров и аминокислот В система реабсорбции сульфата, моно и дикарбоксилатов, а также секреции органических анионов Г система рсабсорбции фосфата и Са2. Действительно, исследователям часто приходилось наблюдать изменение направления транспортного потока при изменении экспериментальных условий i . В последнее время, однако, был достигну определенный прогресс в понимании вопросов взаимодействия отдельных переносчиков. На основе накопленных кинетических данных удалось систематизировать транспоргные системы проксимальных канальцев с точки зрения субстратной предпочтительности. Наиболее значимые из них отражены на схеме рис. Более подробно к этому вопросу мы вернемся ниже. Здесь же хочется отметить, что такие вещества, как оксалат , , урат , , интермедиаты цикла Кребса i . Удивительной биохимической особенностью почечной системы транспорта органических анионов являегся ее способность транспоргировать через клеточный слой широкий спектр веществ разного химического строения. Это может быть обусловлено либо особенностями строения активного центра переносчика, либо наличием в мембране переносчиков нескольких типов. Производные бензойной кислоты например, пробенецид, флуоресцеин. Производные ацетата и пропионата например, 5гидроксииндолуксусная кислота, диодраст, этакриновая кислота, пирсалил. Гетероциклические карбокислоты например, иеницилин и другие антибиотики псницилинового рядя. Органические сульфокислоты например, феноловый красный и другие родственные ему красители. Сульфаниламиды. Некоторые аминокислоты и их производные например. Некоторые пурины и их производные например, мочевая кислота, амантоин, ксантин. Некоторые жирные кислоты и их производные например, простогландины и Е. Повидимому, в дальнейшем список органических кислот, способных выводиться системой транспорта органических анионов, будет увеличиваться, и в нем могут появиться новые, сточки зрения химического строения, группы.