Ca2+-чувствительность миозина поперечно-полосатых мышц позвоночных

• Автор: Малышев, Сергей Львович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 114 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ

ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТЫХ МЫШЦ ПОЗВОНОЧНЫХ.

1.1. Структура миозиновой молекулы

1.2. Структура миозиновых нитей.

1.3. Струкгура тонких актинсодержащих нитей

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПРИРОДЕ

МЕХАНОХИМИЧЕСКОГО СОПРЯЖЕНИЯ.

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СЛ2 РЕГУЛЯЦИИ

МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ .V
3.1. Понятие Са2регуляции на уровне белков сократительного аппарата мышцы.
3.2. Понятия актинового и миозинового пути регуляции
3.2.1. Запуск сокращения в поперечнополосатых мышцах позвоночных
основные модели регуляции актинового типа.
3.2.1.1. Модель стерического блокирования.
3.2.1.2. Аллостерическая модель регуляции.
3.2.1.3. Кооперативная модель.
3.2.1.4. Структурные аспекты регуляции акгинового типа
3.2.2. Регуляция миозинового типа.
3.2.2.1. Запуск сокращения в поперечнополосатых мышцах моллюсков
прямое связывание Са с регуляторным доменом миозина.
3.2.2.2. Запуск сокращения в гладких мышцах позвоночных
фосфорилирование РЛЦ.
3.3. Двойная регуляция
3.4. Другие регуляторные системы в мышцах с актиновым и миозиновым
типами регуляции запуска
3.5 Вклад миозина поперечнополосатых мышц позвоночных
в Са2регуляцию сокращения.
3.5.1. Физиологическое значение фосфорилирования
3.5.2. Прямое связывание ионов Са2 с миозином
3.5.3. Существенные легкие цепи СЛЦ, как возможные модуляторы
регуляторных свойств миозина.
РЕЗЮМЕ.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
4.1. Выделение и очистка белковых препаратов
4.1.1. Получение дефосфорилированного скелетного миозина
4.1.2. Получение фосфорилированного скелетного миозина
4.1.3. Получение сердечного миозина.
4.1.4. Получение скелетного миозина с избирательно удаленными РЛЦ ДТНБмиозин.
4.1.5. Выделение и очистка актина.
4.2 Определение концентрации белков.
4.3. Измерение скорости АТФазной реакции реконструированного актомиозина
4 4 Приготовление образцов для электронномикроскопических исследований.
4.4.1. Формирование реконструированных миозиновых нитей.
4.4.2. Методика негативного окрашивания.
4.4.3. Электронномикроскопические исследования.
4.5. Электрофорез в полиакриламидном геле
4.5.1. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия
4.5.2. Электрофорез в присутствии мочевины.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5 ВЛИЯНИЕ ИОНОВ Са2 НА КАТАЛтИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
МИОЗИНА СКЕЛЕТНЫХ И СЕРДЕЧНЫХ МЫШЦ
5.1. Постановка экспериментальной задачи.
5.2. Акгинактивируемая АТФазная активность скелетного и сердечного
миозинов при ц0.
5.3. Акгинактивируемая АТФазная активность скелегного и сердечного
миозинов при ц
5.4. Сравнение АТФазных свойств колоночного и доколоночного
скелетных миозинов.
5.5. Влияние фосфорилирования РЛЦ на АТФазные свойства скелетного миозина
5 6. Сохранность легких цепей миозина поперечнополосатых мышц, как один из
главных критериев проявления Са2 чувствительности его АТФазных свойств
5.6.1. АТФазная активность скелетного миозина с удаленной РЛЦ
5.6.2. АТФазная С а2чувствительность и сохранность СЛЦ.
5.7. Обсуждение
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ Са2 НА СТРУКТУРУ РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ
НИТЕЙ МИОЗИНА ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТЫХ МЫШЦ ПОЗВОНОЧНЫХ
6.1. Постановка экспериментальной задачи.
6.2. Са2зависимые изменения структуры реконструированных нитей миозина
поперечнополосатых мышц позвоночных в растворе, не содержащем АТФ модели кальциевого и бескальциевого ригора.
6.2.1. Структура нитей дефосфорилированного миозина.
6.2.2. Структура нитей фосфорилированного миозина.
6.2.3. Структура нитей миозина с удаленными РЛЦ.
6.3. Са зависимые изменения структуры реконструированных нитей миозина
поперечнополосатых мышц позвоночных в АТФсо держащем растворе
6.4. Связь между структурной и АТФазной Са2чувствительностью миозина
6.5. Обсуждение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АДФ аденозин 5дифосфат
АТФ аденозин 5трифосфат
АТФаза аденозинтрифосфатаза
дсн доденилсульфат натрия
ДТНБ 5,5дитиобис 2нитробензойная кислота
ДЭЛЭсефадекс диэтиламиноэтилсефадекс
ИПС искусственные подвижные системы
кДа килодальтон
ЛММ легкий меромиозин
лц легкие цени
РЛЦ регуляторная легкая цепь
С1 субфрагмент
С2 субфрагмснт
СЛЦ существенная легкая цепь
ТЦ тяжелая цепь
Ф неорганический фосфат
ЭДТА этиленд иам и нтетраацетат
ЭГТА этиленгликоль бисраминоэгиловый эфир М,М,М,Мтетрауксусной
кислоты
ВВЕДЕНИЕ


В основе мышечного сокращения лежит скольжение толстых миозинсодержащих и тонких актинсодержащих нитей относительно друг друга без изменения их длины гипотеза скольжения . Н. x Ii, . Согласно общепринятым представлениям Н. Этот процесс обеспечивается энергией гидролиза АТФ АТФазой миозина, активируемой актином, и запускается увеличением
внутрисаркомерной концентрации свободного кальция от М до М В последнее время достигнут значительный прогресс в изучении структуры актина и головок миозина на атомном уровне . СаЛ регуляции до сих пор окончательно не ясны. Поперечнополосатые мышцы позвоночных, скелетные и сердечные, традиционно служат основным объектом мышечных исследований. Они изучены более детально, чем, например, гладкие мышцы или мышечные системы беспозвоночных. Получить качественно новую информацию об этих мышцах крайне сложно, поскольку новые экспериментальные данные интерпретируются, как правило, в русле классических моделей. К примеру, ключевым событием в запуске сократительной активности скелетных и сердечных мышц
является присоединение Са к тропонину С тропонинтропомиозинового комплекса, локализованного на тонких нитях актиновый тип регуляции i , . Как
следствие, большинство работ в области Са регуляции поперечнополосатых мышц акцентируют основное внимание на тонких нитях и направлены на уточнение той или иной модели регуляции актинового типа. В то же время, роль миозина в регуляции поперечнополосатых мышц до сих пор не выяснена. При этом, прежде всею имеется ввиду влияние фосфорилирования миозина на силу и скорость сокращения. На сегодняшний день можно сказать, что общие принципы регуляции сокращения, в первую очередь, запуска сокращения, более или менее изучены, однако многие важные детали, а, главное, необычайная сложность этого процесса только начинают осмысливаться. Это справедливо в отношении всех известных типов мышечной регуляции. Так, в случае гладких мышц позвоночных и поперечнополосатых мышц моллюсков миозину отводилась исключительная роль в запуске сократительной активности регуляция миозинового типа. Долгое время считалось, что в гладких мышцах регуляция сокращения полностью исчерпывается циклом Са2 зависимого фосфорилированиядефосфорилирования регуляторной легкой цепи РЛЦ миозина , , а в поперечнополосатых мышцах моллюска прямым присоединением Са к высокоспецифичному участку связывания, образуемому двумя легкими цепями и участком тяжелой цепи миозина в так называемом регуляторном домене Xi . Между тем, в последнее десятилетие классические представления о Сарегуляции сокращения в мышцах с миозиновым типом регуляции подверглись существенной ревизии. В гладких мышцах была открыта регуляторная система тонких нитей, включающей в себя белки тропомиозин, кальдссмон и кальпонин см. Таким образом, имеются основания полагать, что Са2 регуляция сокращения во всех типах мышц является комплексной. В то же время работ, посвященных исследованию собственных Са2связывающих свойств миозина поперечнополосатых мышц позвоночных, практически нет, а те, что есть, не имеют должного научного резонанса. Отдельные сообщения о Са зависимости актинактнвируемой АТФазы скелетного миозина в отсутствие трононинтропомиозииового комплекса , i , i . Тестирование струкгурных реакций на Са у изолированных молекул миозина изменение конформационных характеристик при связывании Са2 в условиях, заведомо далеких от физиологических, не позволяют рассматривать их в связи с событиями, происходящими в живой мышце. В настоящей работе мы поставили цель изучить действие ионов Са в концентрациях, соответствующих состояниям покоя и активации, на функционально важные каталитические и структурные свойства миозина скелетных и сердечных мышц и формируемых им нитей. Изучение проведено с использованием биохимических методов для измерения ЛТФазной активности и элеюронной микроскопии для тестирования структурных характеристик. Выбор реконструированных нитей миозина, в качестве адекватной i vi модели для изучения структурнофункциональных свойств миозина представляется оправданным.