Разработка биореактора для системы "биологическая искусственная печень"

• Автор: Соловьев, Валерий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 103 с.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Общее представление о системе биологическая искусственная печень

1.2. Гепатоциты в системе ИП

1.3. Биореакторы для системы биологическая искусственная печень

1.3.1. Биореакторы для суспензионных клеточных культур без иммобилизации клеток

1.3.2. Биореакторы, основанные на использовании иммобилизованных клеток

1.3.3. Биореакторы, основаннце на использовании полупроницаемых мембран, обеспечивающих массообмен и иммобилизацию клеток в аппарате.

1.3.4. Биореакторы, предназначенные для культивирования фрагментов

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование функционального состояния гепатоцитов в тканевых фрагментах печени в культуре
3.1.1. Уровень функциональной активности гепатоцитов во фрагментах печени
3.1.2. Зависимость функциональной активности гепатоцитов от исходного уровня гликогена
3.1.3. Зависимость уровня функциональной активности от размеров фрагментов
3.1.4. Зависимость функциональной активности гепатоцитов во фрагментах от уровня кислорода
3.1.5. Оценка интактности гепатоцитов во фрагментах
в культуре по высвобождению ЛДГ
3.1.6. Длительность функционирования
гепатоцитов во фрагментах
3.2. Разработка биореактора
биологическая искусственная печень
3.2.1. Основные принципы построения
и функционирования биореактора
3.2.2. Масштабирование биореактора
3.2.3. Функциональная активность гепатоцитов
во фрагментах печени в новом биореакторе
3.3. Исследование эффективности разработанного биореактора при лечении экспериментальной острой
печеночной недостаточности у крыс
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Попытки перфузии крови больного через трупную печень или печень животных, перекрестного кровообращения, трансплантации донорских гепатоцитов оказались сопряжены с рядом трудностей и не дачи ощутимого результата. Радикально улучшить выживаемость пациентов до в течение года с острыми и хроническими поздние стадии заболеваниями печени позволяет лишь трансплантация донорской печени. Кроме того, значительная часть пациентов имеет медицинские противопоказания к операции, либо психологические или социальные причины для отказа от трансплантации. Длительная иммуносупрессия, применяемая после трансплантации, также обладает рядом негативных побочных эффектов. И, наконец, пересадка донорского органа не оставляет шансов на выздоровление собственной печени, что имеет место в ряде случаев. В качестве биологического компонента предполагается использовать функционально полноценные живые гепатоциты. Наиболее подходящими для этой цели оказались гепатоциты свиньи, в силу своей доступности и метаболического подобия гепатоцитам человека. Помимо осуществления метаболической активности, живые гепатоциты могут секретировать факторы, стимулирующие процессы регенерации в пораженной печени, и этот момент может оказаться даже более важным, чем только компенсация метаболических функций. В научной литературе описано довольно большое количество подобных систем, однако большинство из них не испытано даже на животных, единичные образцы в порядке эксперимента подключались человеку, а в широкую практику не вошел ни один из аппаратов. Причина сложившейся ситуации в высоких требованиях, предъявляемых к устройству, и в недостаточном совершенстве существующих вариантов систем. Основным функциональным элементом системы являются живые клетки, и несовершенство проявляется как раз в том, что в существующих прототипах не решена должным образом задача эффективного и в то же время технологически простого использования гепатоцитов. Это объясняется тем, что система должна содержать достаточно большую массу клеток от до 0 г. В то же время, объем биореактора, в котором размещаются клетки, должен быть небольшим, так как заполняется кровью больного. Поэтому при разработке системы возникает задача высокоплотного культивирования клеток, что само по себе уже является большой биотехнологической проблемой. Следует решить задачу обеспечения эффективного массообмена между клетками и кровью больного. Необходимо также обеспечить надежную иммобилизацию гепатоцитов в перфузионном реакторе, исключающую возможность их уноса потоком. И, наконец, конструкция системы должна давать возможность легко и быстро подготавливать ее к работе, что является важным моментом при практическом использовании, когда нужна оперативность в оказании медицинской помощи. В настоящее время в большинстве существующих прототипов подобных систем используются изолированные гепатоииты, полученные путем ферментативной дезинтеграции печеночной ткани. Однако, использование изолированных гепатоцитов сопряжено с рядом трудностей. Для их выделения нужны специальные ферменты. Для длительного сохранения функциональной активности изолированных гепатоцитов необходимо их прикрепление к подходящему матриксу. Малые размеры клеток усложняют их удержание в потоке крови плазмы. Для преодоления этих проблем приходится предпринимать специальные меры, что усложняет аппаратуру и технологию. В го же время существует возможность использования гепатоцитов в составе микрофрагментов ткани печени. При этом сохраняются все типы клеток печени, межклеточные контакты, естественный многокомпонентный межклеточный матрикс и пространственная структура ткани. Перечисленные факторы крайне важны для длительного сохранения высокой функциональной активности клеток. Методы получения фрагментов ткани размером в доли миллиметра, а также их криоконсервации, хорошо отработаны. Поэтому культура фрагментов успешно применялась и применяется для решения ряда научных и практических задач, например, при исследованиях межклеточных взаимодействий, метаболизма ксенобиотиков, в вирусологии и т.