Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа

• Автор: Иванов, Сергей Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Изготовление микрочипов.

1.2 Иммобилизация белков.

1.2.1 Адсорбционная иммобилизация

1.2.2 Химическая ковалентная иммобилизация белков

1.2.2.1 Иммобилизация по аминогруппам белка

1.2.2.2 Иммобилизация по сульфгидрильным группам белка.

1.2.2.3 Иммобилизация через декстрановыс спейсеры

1.2.3 Иммобилизация за счет комплексообразования.
1.2.4 Иммобилизация в пористых средах
1.2.5 Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных
носителях.
1.2.6 Иммобилизация на полимерных носителях
1.2.7 Иммобилизация в полиакриламидном геле
1.3 Применение микрочипов
1.3.1 Аналитические микрочипы
1.3.2 Функциональные микрочипы.
1.3.2.1 Белокбелковые взаимодействия
1.3.2.2 Белоклипидные взаимодействия
1.3.2.3 БелокДНК взаимодействия.
1.4 Модельные белки
1.4.1 Барназа
1.4.2 Раковоэмбриональный антиген РЭА.
1.5 Методы ускорения анализа на микрочипах.
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1 Приборы и реактивы.
2.2 Изготовление белковых микрочипов.
2.3 Окрашивание белков флуоресцентными красителями.
2.4 Флуоресцентные измерения на чипах
2.5 Введение метакрильных групп в белок
2.6 Оценка эффективности иммобилизации барназы на микрочипе.
2.7 Оценка сохранения биологической активности
модифицированной барназы на примере взаимодействия с барстаром.
2.8 Модификация белка мономерами геля
2.9 Исследование ферментативной активности иммобилизованной
на микрочипе барназы методом МАПЛТОБ МЭ
2. Прямой массспектральный анализ барстара на микрочипах
2. Определение содержания рекомбинантного барстара в лизатах
клеткок.
2. Сэндвичиммуноанализ РЭА.
2. Кинетические измерения на микрочипах.
ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Белковые микрочипы.
3.2 Изготовление гелевых микрочипов
3.3 Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа.
3.4 Введение в молекулу барназы непредельных групп.
3.5 Оценка эффективности иммобилизации.
3.6 Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу
белка на сохранение им биологической активности.
3.7 Метод полимеризационной иммобилизации
3.8 Исследование ферментативной активности иммобилизованной
на микрочипе барназы.
3.9 Количественный флуориметрический анализ барстара на
микрочипах
3. Определение содержания рекомбинатного барстара в лизатах
клеток.
3. Прямой массспектральный анализ барстара на микрочипах
3. Разработка процедуры сэндвичиммуноанализа на белковых
микрочипах на примере РЭА
3. Подбор условий проведения иммуноанализа
3. Одностадийный сэндвичиммуноанализ РЭА на микрочипах
3. Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови
3. Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью
механического перемешивания образца
3. Зависимость интенсивности сигнала и времени выхода на
насыщение кинетической кривой от скорости перемешивания на перистальтическом насосе.
3. Получение калибровочных кривых при проведении анализа с
механическим перемешиванием образца
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. Изготовление микрочипов. Иммобилизация белков. Иммобилизация по сульфгидрильным группам белка. Иммобилизация за счет комплексообразования. Функциональные микрочипы. БелокДНК взаимодействия. Раковоэмбриональный антиген РЭА. Методы ускорения анализа на микрочипах. ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Приборы и реактивы. Изготовление белковых микрочипов. Окрашивание белков флуоресцентными красителями. Оценка эффективности иммобилизации барназы на микрочипе. Сэндвичиммуноанализ РЭА. Кинетические измерения на микрочипах. Белковые микрочипы. Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа. Введение в молекулу барназы непредельных групп. Оценка эффективности иммобилизации. ВЫВОДЫ. 0. В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярнобиологических исследований. Для закрепления белков на матрице микрочипе используются различные носители, такие как стекло, пластик, мембраны, золото, и др. Для иммобилизации белковых молекул на носителях применяют различные способы белки могут быть адсорбированы на носителе физическая иммобилизация или ковалентно связаны с носителем химическая иммобилизация. В большинстве случаев, основной проблемой при создании белковых микрочипов является тот факт, что для сохранения структуры и биологических функций молекулы белков нуждаются в гидрофильном окружении, максимально приближенном к естественным условиям их функционирования. Поэтому, несмотря на большое количество разработанных способов иммобилизации и предлагаемых для изготовления микрочипов носителей, это ограничение создает большие сложности для создания устойчиво работающих и долго хранящихся двумерных белковых микрочипов. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов. В данной работе предложен новый метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий значительно упростить технологическую процедуру изготовления микрочипов. В результате проведенных исследований показано, что микрочипы, полученные с помощью предлагаемого метода, обеспечивают оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков и сохранение ими исходной биологической активности. Белковые микрочипы, изготовленные методом полимеризационной иммобилизации, позволяют проводить многопараметрический анализ образца и могут найти применение как в клинической практике, так и в области научных исследований. ГЛАВА 1. Микрокоптактный метод был разработан Патриком Брауном в году. Микродоза раствора, содержащего иммобилизуемые соединения, наносится на поверхность при контакте пина робота с подложкой микрочипа. Размер капель зависит от размера пина и от гидрофобности поверхности 1,2. Микроструйный метод, изначально разработанный для нанесения краски в струйных принтерах, был успешно адаптирован для нанесения микрочипов 3,4. Раствор вещества под давлением пропускается через тонкий капилляр, ток жидкости прерывается поршнем, осциллирующим с высокой частотой под воздействием пьезоэлектрического кристалла. Образующиеся микрокапли получают электрический заряд на электроде и далее, контролируемые электрическим полем, создаваемом двумя параллельными пластинками, попадают на подложку микрочипа. Объем капель регулируется с помощью выбора частоты осцилляции поршня. Блюснее электронапыление, разработанное Моерманом в году 5,6 использует принцип электрораспыления жидкостей.