Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы

• Автор: Женило, Светлана Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

Введение.

1.1.Метилирование генома эукариот и растений.

1.2. ДНК мстилтрансфсразы. Защита от v метилирования.

1.3. X инактивация. Геномный импринтипг.

1.4 Метилирование ДНК и заболевания.

1.5 Модификации гистонов. Связь метилирования ДНК и модификации гистоиов

1.6 МетилДНКсвязывающис белки.

1.7 Краткая характеристика белков семейства .

2. Материалы и методы.

2.1.3. Оли гону клсоитиды для клонирования полноразмерных i, 4,

и цинковых пальцев 4 и для имуниофлуорссцснции.

2.1.4.Олигонуклеотиды для анализа результатов по иммупопрецннитации хроматина методом ПЦР.
2.1.5. Олигонуклеотиды, использованные для РТПЦР.
2.1.6. Олигонуклеотиды для получения i
2.2. Полноразмерные кДНК i, 4, .
2.3. Полимеразная ценная реакция
2.3. Трансформация .i и выделение плазмиднон ДНК
2.4. Получение компетентных клеток
2.5. Клонирование ПЦРпродукта
2.6. Получение радиоактивно меченых ДНКзондов для экспериментов но торможению ДНКбелковых комплексов в геле
2.7. Исследование ДНКбелкового взаимодействия методом задержки подвижности в геле ДНКбелкового комплекса
2.8.Иммунопреципитацня хроматина
2.9. Нозерн блот гибридизация и количественный РТПЦР.
2 Клеточные линии и временная трансфекция.
2 МетилзависимыЙ реирессионый тест.
2 Иммупофлуоресцспцня и микроскопия.
2 Клонирование цинковых пальцев i, 4, для i vi трансляции.
2 Клонирование полноразмерных i. 4, и цинковых пальцев данных белков для иммунофлуоресценцин.
2 Клонирование делений 4 и для метилзавиенмого реирессиопого теста.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Два новых белка 4 и , гомологичных i, узнают метилнрованую ДНК i vi
3.2. 4 и связывают мстилированую ДНК i viv.
3.3 4 и являются мстилзависнмыми репрессорами.
3.4. Картина экспрессии 4 и
Заключение
Благодарности.
Список Литературы


Необходимость репрессии транскрипции транспозонов связана либо с ограждением организма от спонтанных перестроек, которые, хотя и не наследуются, но могут привести к развитию ряда генетических заболеваний либо с понижением уровня транскрипционного шума, который может быть создан экспрессией многочисленных мобильных элементов. Понимание процессов эпигенетического репрограммирования, изучение белков вовлеченных в этот механизм является важным для лечения многих заболеваний рак 2, задержка умственного развития, которые связаны с изменением статуса метилирования ДНК или структуры хроматина. Известно, что метилирование ДНК часто связано с подавлением транскрипции. Метилирование промоторных участков вызывает сильное и наследуемое подавление транскрипции определенных генов 3. Понимание механизма метилчувствителыюй репрессии пришло в связи с открытием белков, которые могут распознавать метилированую ДНК и подавлять транскрипцию. У позвоночных белки, содержащие метилДНКсвязывающий домен МВО домен, представляют большой класс белков МВ, МеСР2, МВЭ2, МВОЗ, МВ, которые могут связываться с одиночными метилироваиыми Срв парами и которые участвуют во многих процессах в контроле стабильности генома, раннем эмбриональном развитии, созревании нейронов, дифференцировке Т клеток и др. Но с другой стороны МВО белки не являются единственными, распознающими метилированую ДНК белок Ка1БО взаимодействует с метилироваиыми СвСС с помощью трех цинковых пальцев 5, а не за счет МВО домена. Кроме этого Као может взаимодействовать и с иеметилированой последовательностью ТССГССЫА 6. На данный момент возможно существование и других метилДНК связывающихся белков, так как по нашим данным в клеточных линиях, в которых отсутствуют МВ, МВ, Меср2 и Ка1БО попрежнему наблюдаются белки с метилспецифической активностью. В данной работе проведен поиск, изучение и характеристика нового семейства метилДНК связывающих белков. Метилирование генома эукариот и растений. Метилирование ДНК известно уже для генома прокариот, что говорит о фундаментальном значении этого процесса в жизни клетки. В частности, в геноме прокариот метилирование аденозина в ОАТСпоследовательностях приводит к ошибкам копирования в ходе рекомбинации, с другой стороны метилирование аденозина и цитозина в определенных последовательностях защищает бактерию от ее собственных рестриктаз и является защитой от внедрения чужеродных последовательностей ДИК 7. Метилирование ДНК у млекопитающих является пострепликационной модификацией. Обычно метилируется цитозин по 5 положению пиромидинового кольца в составе СрС динуклеотида. Хотя у растений значительный уровень метилированых цитозинов обнаружен не только в контексте Срв, айв СЫв и СЫЫ последовательностях где ЫА,Т или в 8. Примерно около Срв динуклеотидов в геноме млекопитающих метилированы, в основном метилированая ДИК расположена в различных повторяющихся элементах. Около генома человека состоит из повторов различных транспозонов, эти участки Срв богаты и метилированы 9. Области, содержащие транспозоны и другие повторы, обычно находятся в неактивном хроматине, защищая, таким образом, организм от работы чужеродной ДНК. Высокий уровень метилированых цитозинов также наблюдается на неактивной Ххромосоме и в импринтированых локусах . Большинство неметилированых Срв пар расположено примерно в ,0 Срв островках, которые обычно расположены недалеко от промотора и первого экзона генов, кодирующих чаще всего гены домашнего хозяйства, то есть экспрессируемых в клетках любого типа, кодирующих белки, необходимых для жизнедеятельности клеток . До сих пор остается неясным механизм, почему Срв островки избегают метилирования. Изменение статуса метилирования Срв островков часто связано с различными видами рака у человека . Степень метилирования ДНК изменяется в процессе развития организма. Так, например, в половых клетках практически весь геном метилирован и неактивен, за исключением генов, присущих яйцеклетке и сперматозоиду. После слияния яйцеклетки и сперматозоида, у человека, мыши и у свиньи до первого деления начинается активное деметилирование отцовского генома, а материнский остается заметилирован. У овцы, кролика, коровы отцовский пронуклеус не деметилируется.