Использование остаточных диполь-дипольных взаимодействий для изучения структуры и динамики белков

• Автор: Крачковский, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Оглавление.
ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Барназа.

Начальные сведения.

Ферментативная активность барназы.

Структурные исследования барназы

Внутримолекулярная подвижность в барназе

Применение остаточных дипольных констант для анализа структуры и динамики бел кон

Остаточные дипольдипольные взаимодействия

Матрица порядка Саупе.
Механизмы ориентирования белка
Применение остаточных дипольных констант для уточнения пространственной структуры.
Распознавание структур и вписывание гомологичных моделей
Определение взаимной ориентации доменов белка при помощи дипольных констант.
Заключение . Н1ММИ1а11ММММНМ1ааМ1М1ИММНЖ1ИИ1ННМИН1
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Приготовление образцов и измерение дипольных взаимодействий
Структура барназы дикого типа. .
Программа .
Расчт параметров тензора ориентации молекулы и оценка достоверности используемых моделей х2.
Алгоритм проведения кластеризации
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Исследование изменений в структуре барназы вызванных введением мутации ЕА
Исследование динамических особенностей барназы при помоши остаточных КДДВ
Сравнение динамических доменов, полученных при помощи ЯМР и МД.
Анализ соответствия КДДВ барназы дикого типа известным кристаллографическим структурам барназы.
Доменные движения как возможный источник ферментативной активности барназы.
Заключение. .
ПРИЛОЖЕНИЯ.
Импульсные последовательности, используемые для измерения КДДВ.
Измерение КДДВ От 0Н
МодификациятНБОР для измерения КДДВ .
Эксперимент для одновременного измерения КДДВОт 1Оцс и 2Оцнс ф,ДЕО8УНС .
Измерение КДДВ 1.
Значения КДДВ, измеренные для мутанта барназы ЕА.
Значения КДДВ, измеренные для белка барназы дикого типа
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ЯЭО и КССВ ,. Эксперименты по измерению констант дипольного и спинспинового взаимодействия проводятся гораздо быстрее, чем эксперименты по измерению ЯЭО и могут применяться к большим белкам, следовательно, они являются очень эффективными при определении структуры молекул методом ЯМР. Поэтому, в настоящее время для расчета структур больших мультидоменных белков и для оценки их динамических параметров часто пользуются ЯМРметодиками, основанными на измерении КДЦВ ,,. Однако, по ходу выполнения работы, в имеющихся методиках были выявлены некоторые существенные недостатки, связанные с необходимостью наличия определенных знаний о структуре исследуемой молекулы в частности о наличии и составе динамических доменов. Для устранения указанных трудностей был предложен и реализован алгоритм независимого выделения в белке динамических доменов и определения параметров их движения друг относительно друга. Разработанный алгоритм подробно описывается в главе Материалы и методы, а его тестирование в Результаты и обсуждения. В качестве объекта исследования и тестирования предложенных методик нами была выбрана барназа представитель класса небольших бактериальных рибонуклеаз. Часто каталитическая активность ферментов регулируется их конформационными изменениями, которые возникают в ответ на взаимодействие с лигандом или ковалентные модификации, например фосфорилирование ,. Обычно эти изменения можно представить как переходы между определенными устойчивыми энергетически выгодными состояниями молекулы белка. Благодаря этим переходам осуществляется связываниевысвобождение субстрата или ингибитора, достигается правильное расположение каталитических групп, а также аллостерическое регулирование ,,,,,. Взаимосвязь между внутренней динамикой белка в микро и миллисекундном временном диапазоне и ходом каталитической реакции была показана для циклофилина А и биназы . Один из наиболее изученных классов ферментов это рибонуклеазы. Они встречаются в любом живом организме, от прокариот до млекопитающих. Рибонуклеазы в рамках своей функциональной акгивности гидролиза молекул РНК оказываются задействованными в широком спектре метаболических процессов. Изучение взаимосвязи между структурой, внутренней динамикой и функциями этих белков вносит значительный вклад не только в изучение молекулярных основ ферментативного катализа, но, кроме этого, дает возможность приблизиться к пониманию многих процессов клеточного метаболизма на молекулярном уровне. Один из представителей класса небольших бактериальных рибонуклеаз барназа внеклеточный фермент, секретируемый i ii. Барназа является хорошо изученным белком, исследованию ее структуры и функций посвящено большое количество работ ,,,. К настоящему моменту выполнено много работ по клонированию барназы и ее мутантов, подробно исследованы их каталитические свойства, получено множество данных по термодинамике белка ,,. Кроме того, при помощи метода молекулярной динамики МД показано большое значение доменных движений для энтропийной стабилизации барназы . Выявлено, что в барназе можно выделить два динамических домена, а также получены амплитуды основных коллективных мод, на которые можно разложить внутренние движения белка. Представленная динамическая модель хорошо согласуется с данными, полученными при помощи сайтспецифического мутагенеза ,,,,. Тем не менее, результаты МД исследований требуют независимого экспериментального подтверждения. Для этого, вопервых, изучаются изменения в структуре белка, вызванные мутацией ЕА, которая препятствует образованию солевого мостика КЕ и, как ожидается, должна приводить к стабилизации открытого состояния фермента . А вовторых, исследуются динамические характеристики барназы дикого типа. Работа выполнена в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН и является составной частью проводимых в институте исследований структуры и функции биологических макромолекул.