Разнообразие компактных форм денатурированных белков

• Автор: Уверский, Владимир Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 410 с. : ил.

Моей семье с любовью благодарностью

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА I. ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА II. СКОЛЬКО СУЩЕСТВУЕТ РАЗЛИЧНЫХ РАСПЛАВЛЕННЫХ
ГЛОБУЛ?
1. Введение
2. Белковая молекула как объект физических исследований. Основные определения
3. История открытия расплавленной глобулы
4. Разнообразие денатурированных форм белковой молекулы - расплавленная глобула, высоко структурированная расплавленная глобула, предшественник расплавленной глобулы
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. КОМПАКТНЫЕ ДЕНАТУРИРОВАННЫЕ СОСТОЯНИЯ И СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ 32 ГЛАВА III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ КОМПАКТНЫХ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ СОСТОЯНИЙ
БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
§1. Как зарегистрировать формирование равновесного промежуточного состояния? Общее состояние вопроса
§2. Условия эксперимента
§3. Высокоэффективная гель-фильтрация как уникальный инструмент для количественного и качественного описания процессов денатурации и
разворачивания глобулярных белков
п. 3.3. а. Введение
п. 3.3. б. Определение величин радиуса Стокса для нативных и полностью
развернутых белков (анализ литературных данных)
п.3.3.в. Количественный анализ разворачивания глобулярных белков сильными денатурантами с помощью гель-фильтрации
п.З.З.г.1. Калибровка гелъ-филътрационной колонки Виреголе
п.3.3.г.2. Определение величин радиуса Стокса для нативных и полностью
развернутых белков с помощью гель-фильтрации
п.З.З.г.З. Определение величин радиуса Стокса для белков в состоянии
расплавленной глобулы с помощью гель-фильтрации

п. 3.3.д. Качественный анализ процессов денатурации и разворачивания глобулярных белков с помощью гелъ-филътрацт. Получение кривых, описывающих структурные переходы в белках
п. 3.3. е. Гель-фильтрация прямо указывает на существование переходов типа “все-или-ничего ” между компактным и менее компактным состояниями белковой молекулы
п. 3.3.ж. Использование гель-фильтрации для разделения конформационных состояний, отличающихся по гидродинамическим размерам, и исследования их свойств
§4. Применение метода затухания флуоресценции гидрофобного зонда 8-
АНС для исследования структурных превращений в глобулярных белках
п. 3.4.а. Введение
п. 3.4.б. Самоассоциация молекул 8-АНС. Спектральные характеристики
п. 3.4. б. 2. Спектральные свойства 8-АНС в водных растворах
Влияние само ассоциации на спектральные свойства 8-АНС
Роль ионов Мур* в ассоциации молекул АНС
п.3.4.6.3. Спектральные свойства 8-АНС в органических растворителях
Общий эффект растворителя на спектральные свойства 8-АНС
Влияние ассоциации на спектральные свойства молекул 8-АНС в органических растворителях
Влияние ионов магния на спектральные свойства 8-АНС в органических растворителях
п.3.4.6.4. Спектральные свойства 8-АНС в комплексах с белками
Характеристики затухания флуоресценции зонда в комплексах АНС-
белок
Короткоживущая компонента флуоресценции комплексов АНС-белок относится к молекулам зонда, находящимся на поверхности белковой молекулы и доступным растворителю
Долгоживущая компонента флуоресценции комплексов АНС-белок относится к молекулам зонда, погруженным внутрь белковой молекулы и недоступным растворителю
Использование метода затухания флуоресценции гидрофобного зонда 8-АНС для исследования структурных превращений в глобулярных
белках
Долгоживущая компонента флуоресценции комплексов 8-АНС-белок больше в том случае, когда зонд взаимодействует с белком, находящимся в состоянии расплавленной глобулы
Модельный механизм флуоресценции 8-АНС в комплексах этого зонда

оборудования FPLC ("Pharmacia"). Профили элюции регистрировали с помощью спектрофотометра 2158 Uvicord CD ("LKB") с использованием фильтра 226 нм.
Времена жизни флуоресценции измеряли, используя фазовый спектрофлуориметер с Фурье преобразованием SLM 48000 MHF (SLM Instruments, IL, USA). Для возбуждения флуоресценции в таких экспериментах использовали источник постоянного света - линию 325 нм гелиево-кадмиевого лазера (Плазма, Рязань, Россия). Поскольку это полоса не очень интенсивна, то данная установка позволяла изучать характеристики затухания флуоресценции только в растворах с относительно высоким уровнем интенсивности флуоресценции. Для измерения времен жизни флуоресценции АНС в водных растворах, где интенсивность флуоресценции была очень мала, использовали импульсный подход. В этом случае возбуждение флуоресценции осуществлялось на длине волны 263 нм короткими импульсами (250 фс, частота 83 Мгц, энергия одного импульса - 42 мв), получаемыми с помощью титаново-сапфирового лазера Tsunami (Spectra Physics Ltd., Mountain View, USA). Затухание флуоресценции регистрировалось с помощью установки Streak Camera С-4334 (Hamamatsu Inc., Japan). Временное окно таких измерений было равно 2 не. Спектры флуоресценции получали используя спектрофлуориметр SFM-25 (Tegimenta, Switzerland), а спектры поглощения исследовали с помощью спектрофотометра Cary 4Е UV-VIS (Varian, Mulgrave, Australia).
Эксперимент. Измерение времени жизни флуоресценции фазово-модуляционным методом. Свет от лазерного источника модулировали с помощью ячеек Поккеля, управляемых мультигармоническим генератором высоких частот. Желаемые частоты, в интервале от 5 до 250 Мгц накладывались на их гармоники и использовались для возбуждения ячеек Поккеля. Таким образом, образец возбуждался модулированным светом, форма импульсов которого определялась набором наложенных частот. Излучаемый образцом свет, также был модулирован, но его Фурье спектр отличался от спектра Фурье возбуждающего света, имея фазовый сдвиг ф и уменьшение глубины модуляции М для каждой частоты.