Структура и каталитические свойства системы "трипсин - обращенная мицелла" в условиях изменения температуры

• Автор: Захарченко, Наталия Леруновна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. МИКРОЭМУЛЬСИИ ВОДАМАСЛО КАК СРЕДА ДЛЯ

БИОХИМИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

1.1. Высокоорганизованные системы на основе поверхностноактивных веществ.

1.2. Структура и физикохимические свойства обращенных мицелл

1.3. Методы исследования структуры обращенных мицелл

,1.3.1. ЯМР самодиффузия.

1.3.2. ЭПР спиновых зондов

1.3.3. Кондуктометр ия

1.3.4. Другие методы исследования.

1.4. Мицеллярный каталитический эффект
1.5. Ферменты в обращенных мицеллах.
Глава 2. МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования.
2.2. Кондуктометрия.
2.3. Исследование структуры монослоя ЛОТ обращенных мицелл методом ЭПР спинового зонда.
2.4. Исследование структуры микроэмульсии методом ЯМР
самодиффузии
2.5. Исследование структуры белка методом ИКспектроскопии
2.6. Кинетические измерения.
Глава 3. СТРУКТУРА МИКРОЭМУЛЬСИЙ ВОДАМАСЛО И ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕАГЕНТОВ.
3.1. Температурные изменения в структуре системы обращенных мицелл, стабилизированных ЛОТ. ЯМРсамодиффузия и электропроводность
3.2. Влияние модифицирующих добавок на процесс кластеризации обращенных мицелл.
3.3. Определение локализации субстрата по данным методов ЯМРсамодиффузии и электропроводности.
3.4. Изменения в структуре гидрофобного слоя обращенных мицелл под действием иммобилизованного фермента.
Глава 4. ТЕМПЕРАТУРНЫЙ ФАКТОР И КИНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ В ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ДЕЙСТВИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.
4.1. Щелочной гидролиз инитрофенилэтилхлорметилфосфоната в условиях кластеризации обращенных мицелл
4.2. Щелочной гидролиз ннитрофенилацетата в системе обращенных мицелл.
Глава 5. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРИПСИНА В УСЛОВИЯХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В МИКРОЭМУЛЬСИОННОЙ СРЕДЕ .
5.1. Температурный фактор и каталитическая активность трипсина в системе обращенных мицелл
5.2. Температурные изменения в структуре трипсина.
5.3. Влияние микроокружения на каталитическую активность
трипсина в системе обращенных мицелл.
ВЫВОДЫ .
ЛИТЕРАТУРА


Система обращенных мицелл представляет собой одну из структурных разновидностей микроэмульсий Миттел, дисперсию микрокапель воды в органической жидкости. Поверхность водных микрокапель стабилизируется мономолекулярным слоем ПАВ, полярные головные группы которого расположены на водной поверхности микрокапли, а углеводородные радикалы ориентированы в сторону объемной органической фазы. Березин, 1 простота приготовления 2 возможность изменения в широких пределах количества воды в микроокружении фермента 3 термодинамическая устойчивость и оптическая прозрачность систем, позволяющая контролировать структуру и каталитическую активность фермента спектральными методами 4 обеспечение реакционного контакта водорастворимого фермента с водонерастворимыми субстратами. Несмотря на то, что природа не подготовила ферменты для функционирования в системах с органическим растворителем, изучение закономерностей биокатализа в таких системах позволяет получать принципиально новые данные о стабильности белков и силах, поддерживающих каталитически активную конформацию ферментов Гладилин, . Установлено, что многие ферменты демонстрируют хорошую стабильность и высокую активность в системах обращенных мицелл, хотя в сравнении с водной средой могут проявлять специфические особенности изменение оптимума , субстратной специфичности и др. Особенности поведения ферментов в системе обращенных мицелл имеют многочисленные экспериментальные подтверждения. Для объяснения суперактивности и субстратной специфичности ферментов в этих средах предложены теоретические модели, в которых рассматриваются различные аспекты влияния микроокружения на ферменты изменения в структуре молекулы фермента , ii, , увеличение жесткости молекулы фермента под действием мицеллярной матрицы vv, , , солевые эффекты , vi, и пр. Параллельно, на протяжении последних десятилетий постоянно возрастает интерес к использованию различных микроэмульсионных сред, в частности обращенных мицелл, в качестве среды для проведения различных химических процессов не только ферментативной природы. i, , , x, vv, i, i, . Свойства микроэмульсии в первую очередь определяются составом системы. Вместе с тем, хорошо известно i, , что вносимые добавки, в том числе химические и биохимические реагенты, могут существенно модифицировать се структуру и физикохимические свойства. Одной из наиболее распространенных в мицеллярной энзимологии систем является обращенная микроэмульсия, стабилизированная анионным ПАВ Аэрозолем ОТ ЛОТ. Наряду с такими свойствами, выигрышными с позиций мицеллярной энзимологии, как высокая солюбилизирующая емкость по отношению к воде, незначительное распределение по размерам мицелл, эта система характеризуется тенденцией мицелл к кластеризации i, . Условия, при которых происходит спонтанная кластеризация мицелл в обращенных микроэмульсиях на основе ЛОТ, являются следствием внутренних перестроек в мицеллах. При этом возможны локальные изменения параметров локального микроокружения солюбилизированных реагентов. Основной пелыо работы является изучение структурных характеристик обращенных микроэмульсий на основе АОТ как среды для ферментативных процессов, а именно для гидролитического расщепления сложноэфирных связей в присутствии трипсина, и поиск взаимосвязи между структурными и каталитическими характеристиками системы. Изучить температурные изменения в структуре обращенных микроэмульсий методами ЯМРсамодиффузии и кондуктометрии. Исследовать влияние добавокреагентов на структуру гидрофобной оболочки обращенных мицелл на основе АОТ методами ЭПР спинового зонда и кондуктометрии. На примере щелочного гидролиза сложных эфиров изучить каталитический эффект системы обращенных мицелл в условиях ее структурных перестроек под действием температуры. На примере гидролиза Мабензоил БАЭЭ и 7нитрофснилацетата ПНФА в присутствии трипсина исследовать взаимосвязь структуры и каталитических свойств системы фермент обращенная мицелла.