Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток

• Автор: Капралова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 131 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.

Введение
ГЛАВАI

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы микроинъекции МИ

1. 2. Выживаемость зародышей животных и

человека после МИ

1. 3. Ранний эмбриогенез мыши, стадия бластоцисты

1. 4. Ростовые факторы и цитокины в раннем

развитии зародышей.

1. 5. Роль цитокина I в эмбриогенезе и имплантации.
1. 6. Эмбриональные стволовые клетки ЭСК мыши
1. 7. Методы получения ЭСК.
1. 8. Химерные зародыши и животные.
1 ЛАВА
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.
2. 1. Биологический материал.
2. 2. Ранние зародыши мыши.
2.2.1. Выделение зародышей на стадии бластоцисты.
2.2.2. Культивирование бластоцист i vi.
2.2.3. Выявление биологических эффектов
цитокина I на стадии бластоцисты.
2. 3. Клеточные культуры.
2.3.1. Выделение первичных эмбриональных
фибробластов ПЭФ мыши
2.3.2. Культивирование клеток ПЭФ
2.3.3. Приготовление мигомицинового фидера ПЭФ
2.3.4. Культивирование ЭСК мыши
2.3.5. Культивирование и трансфекция клеток линии 1.
2. 4. Микроинъекция МИ
2.4.1. Оборудования для проведения МИ.
2.4.1. МИ в бластоцисты растворов и целых клеток
2. 5. Оценка жизнеспособности бластоцист мыши
в условиях культуры i vi
2.5.1. Цитохимический тест на выявление
эндогенной щелочной фосфатазы ЭЩФ.
2.5.2. Иммуноцитохимическое определение фактора
транскрипции плюрипотентных клеток
2. 6. Криоконсервация клеточных культур.
2.6.1. Замораживание и хранение ЭСК,
ПЭФ и 1 в жидком азоте
2.6.2. Режимы замораживания и размораживания
клеточных культур.
2. 7. Состав сред и растворов, используемых для
культивирования клеток и ранних зародышей.
2.7.1. Модифицированная среда Виттена МСВ.
2.7.2. Фосфатносолевой буфер .
2.7.3. Раствор ВсрсснЭДТА
2.7.4. ТрипсинЭДТА.
2. 8. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА III
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНР1Е
3.1. МИ в полость бластоцисты среды Виттена
и витальных красителей
3.1.1. Морфофункциональные особенности
блас гоцист после ТУГИ
3.1.2. Развитие зародышей мыши со стадии
бластоцисты i vi
3.1.3. Межлинейные различия в эффективности
культивирования бластоцист после МИ.
3.1.4. Влияние цитохалазина Б на эффективность
культивирования мышиных бластоцист
3.1.5. Повышение эффективности культивирования
бластоцист мышей в среде с цитокином ЫБ.
3.1.6. МИ цитокина ЫГ в полость бластоцисты.
3. 2. Получение химерных бластоцист мыши
3.2.1. Распределение эмбриональных стволовых
клеток ЭСК в полости бластоцисты после МИ.
3.2.2. МИ в полость бластоцисты трансфицированных
клеток линии Соб1
3.2.3. Оценка флуоресценции зеленого белка СРР в первичных эмбриональных фибробластах ПЭФ
мыши после МИ в бластоцисту.
3.2.4. Эффективность развития химерных бластоцист
мыши в культуре.
ГЛАВА IV
ВЫВОДЫ.
Список литературы


, , , i, i, , , . Клонирование клеток и целых животных, связанное с заменой ядра ооцита на ядро соматической или стволовой клетки, невозможно без использования соответствующей МИ техники. В последние годы методы терапевтического клонирования, позволяющие получать большое количество клеток определенного фенотипа, потенциально пригодных для лечения различных заболеваний, в том числе и генетических, высоко ценятся в современной медицине Попов, Языков, , . Первые успешные исследования по клонированию млекопитающих были выполнены в году на лабораторных мышах I, , . Значительный прорыв в этих исследованиях был сделан после сенсационного сообщения о клонировании овечки Долли i . Во многих работах i я. , , , I, , показано, что в организме взрослых животных имеются недифференцированные стволозые клетки, которые могут быть использованы в качестве источников кариопластов для получения клонированных животных репродуктивное клонирование или клеточных линий терапевтическое клонирование. Клонирование целых животных находит применение в сельском хозяйстве для размножения высокоценных пород животных. Однако результаты широкомасштабных исследований по репродуктивному клонированию дают основу для серьезных опасений, особенно, когда речь идет о возможности клонирования человека. Проблемы репродуктивного клонирования затрагивают не только религиозные и этические чувства, но и такие важные вопросы как негативные последствия в виде анеу и полиплоидии ядер, несогласованности цикла пересаженного ядра и цитоплазмы клетки. В результате неполного репрограмирования ядра в цитоплазме энуклеированного ооцита выявляются нарушение имплантации, плацентации и органогенеза. В высокую гибель клонированных животных вносят свой вклад механические и осмотические повреждения, вызванные применением методов МИ. Более успешная область использования МИ в медицине это экстракорпоральное оплодотворение ЭКО. С помощью ЭКО решаются многие проблемы репродукции человека, в том числе, такие как бесплодие, вызванное снижением активности и фертильности сперматозоидов Галат, V, . В этом случае внутрицитоплазматическая инъекция спермия в ооцит является оптимальным решением многих проблем . . Галат, V, i, , . Такой метод позволяет преодолеть видоспецифические ограничения к оплодотворению, благодаря прямому взаимодействию двух гамет. Выживаемость зародышей животных и человека после МИ. Ряд авторов выражает мнение о том, что процедура МИ сперматозоида в ооцит человека не может быть признана рутинной клинической процедурой в связи с недостаточной изученностью последствий для здоровья пациентов и их потомства i, , i . Предполагается, что в результате МИ увеличивает риск нарушения внутриутробного развития плода в раннем постимнлантационном периоде , i, I V . i . Сперматозоиды, имеющие морфофункциоиальные аномалии, могут нести поврежденные гены, которые при оплодотворении с помощью метода МИ становятся участниками формирования нового организма и могут передавать генетические аномалии по наследству i, . i . . В настоящее время уже установлено, что некоторые морфологические отклонения в строении спермиев связаны с дефектами хромосом . , Галат, . Несмотря на огромное число рожденных детей с помощью метода МИ спермия высказываются опасения, что сама процедура может вызвать аномалии развития эмбрионов в результате прокола яйцеклетки i . Кроме того, показано, что после этой манипуляции значительная часть эмбрионов не проходит необходимого числа делений дробления в период доимплантационного развития и погибает i . Галат, . Высокая гибель зародышей животных и человека наблюдается в исследованиях но клонированию на всех этапах развития, начиная с замены ядра ооцита и до рождения жизнеспособной особи.