Сравнительное исследование химерных, мутантных и TAG-форм нуклеозиддифосфаткиназы крысы

• Автор: Орлов, Денис Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общие представления о свойствах и функции нуклеозиддифосфаткиназы. Особенности нуклеозиддифосфаткиназы в клетках

млекопитающих

2. Трехмерная структура КОР киназы

2.1. Пространственная структура субъединицы киназы

2.2. Структура гексамсра КОР киназы .

3. Мультифункциональная роль КОР киназ в клетке .

4. Возможные молекулярные механизмы участия КОР киназ в регуляторных процессах

4.1. Протеинкиназная активность КОР киназы.

4.2. КМ как регулятор транскрипции онкогенов

. Белки, взаимодействующие с КОР киназой.
4.4. КОР киназа как возможный активатор ОТРсвязывающих белков.
5 Взаимодействие КОР киназ с комплексом родопсинтрансдуцин в фоторецепторных мембранах наружных сегментов палочек сетчатки быка
6. Исследование изоформ КОР киназы млекопитающих методом собственной белковой флуоресценции.
7. Заключение. Постановка задачи.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Объекты исследования
2. Получение и очистка производных рекомбинантных изоформ аир КОР киназы крысы .
3. Определение ферментативной активности препаратов КОР киназ
4. Получение препаратов НСП. Получение препаратов мембран НСП
5. Связывание ПАКОР киназ ар и ра с К и Умсмбранами
6. Теория и возможности метода собственной белковой флуоресценции
6.1. Измерения собственной белковой флуоресценции
6.2. Разложение спектров собственной белковой флуоресценции на элементарные компоненты. Теория и применение.
7. рНметрическое титрование
8. Исследование термостабильности КОР киназ
9. Изоэлектрическое фокусирование
. Дополнительные методы
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Ферментативная активность КОР киназ а и р и их производных
2. Сравнительное исследование химерных, мутантных и фм КОР киназы методом собственной белковой флуоресценции.
2.1. Общие флуоресцентные свойства производных КОР киназы а при 8.
2.2. Влияние на флуоресценцию производных КОР киназы а
2.3. Общие флуоресцентные свойства производных КОР киназы Р при 8
2.4. Влияние на флуоресценцию производных КОР киназы р
2.5 Тушение флуоресценции КОР киназы а и р и их производных акриламидом
3. Взаимодействие химерных производных рекомбинантной киназы крысы НА киназы ар и НА киназы Ра с фоторецепторными мембранами НСП сетчатки быка.
4. Исследование термостабильности киназ а и р и их производных
5. Исследование стабильности киназ как
гексамеров
5.1. Использование метода собственной белковой флуоресценции
5.2. Использование метода изоэлектрофокусирования.
6. Заключительное обсуждение. Возможная функциональная роль киназ
в клетках. Трансфосфорилирование связанного .
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Характерная особенность фермента млекопитающих, в отличие от ферментов низших организмов, состоит в том, что в состав гексамера киназы входит два основных типа субъединиц. В связи с этим, киназа в клетках млекопитающих представлена набором гексамеров, состоящих из разного числа субъединиц двух основных типов i . Функциональный смысл существования двух типов субъединиц пока не ясен, тем более что полученные в последнее время рекомбинантные ферменты, состоящие из одного типа субъединиц, имеют принципиально одинаковую активность, субстратную специфичность и трехмерную структуру i , i , , . Однако, существование двух типов субъединиц, повидимому, имеет принципиальное значение для клеток млекопитающих хотя бы потому, что каждый из видов тканей характеризуется своим собственным соотношением между ними i . Кроме того, каждый тип субъединиц кодируется своими собственными генами, структура и регуляторные участки которых различны. Нельзя также не отметить, что первичная структура субъединиц предельно консервативна Рис. Основные различия локализованы в вариабельных областях 1 остатки , 7 замен из и 2 остатки , 6 замен из . Более детально вопрос о функциональной роли двух основных изоформ киназы в клетках млекопитающих будет рассмотрен далее при анализе литературных данных и при рассмотрешш результатов, полученных с использованием рекомбинантных изоформ а и Р киназы крысы киназы а и Р, каждая из которых состоит лишь из одного из двух типов субъединиц. Согласно немногочисленным данным, в клетках млекопитающих в следовых количествах присутствует еще несколько типов белков, подобных основным формам киназы по первичной структуре, но лишь некоторые из них обладают ферментативной активностью. Детальное рассмотрение этих данных выходит за рамки настоящей работы. I II. IIIVI. IIVIIV. Рис. Первичные структуры субъединиц киназы из различных видов. Красным цветом выделены вариабельные области VI остатки и V2 остатки ферментов млекопитающих. Элементы вторичной структуры остатки 5, аО , а , , аА , 2 , , аЗ , петля Крп 6, р4 , а4 . Трехмерная структура киназы. Пространственная структура субъединицы киназы. Типичная трехмерная структура субъединицы киназы показана на Рис. Основу структуры составляет компактный домен , представляющий собой чередование слосв и спиралей и соединений с внешним Сконцевым участком длиной в остатков. Домен строится из антипараллелыюй структуры, имеющей топологию 2 Рис. Этим киназа отличается от всех других известных фосфокиназ и большинства нуклсотидсвязывающих белков, которые строятся вокруг параллельной структуры. Спираль соединена с и затем с 2, а спираль аЗ соединена с 3 и затем 4. Эти спирали ограничивают одну из сторон собранных вместе четырех структур. В целом, структура и соединяющие спирали составляют широко распространенный структурный тип, который обычно обозначается как упаковка или так называемый ферредоксиновый мотив, обнаруженный впервые у белка ферредоксина. Данный мотив найден у ряда белков, которые, тем не менее, не проявляют заметной гомологии с киназой по первичной структуре и функционально отличны от нес. К числу таких белков относятся, в частности, некоторые представители семейства связывающих белков например, рибосоматьный белок 6, домен полимеразы и рибосомальный фактор элонгации . Основу гидрофобного ядра субъединицы составляют структура 3 Рис. З. По своей первичной последовательности структуры типа 3 практически подобны у всех известных киназ и очень гидрофобны. Структура 2 богата лейцином i i, гидрофобна и скрыта от взаимодействия с растворителем в результате взаимодействия с гидрофобной зоной соседней субъединицы, входящей в состав димеров, образующих гексамер. Дополнительными структурными элементами субъединиц гексамера киназ, помимо ферредоксинового мотива, является пара аспирапсй ада2 остатки , которые образуют мотив, соединяющий структуры 2 и 3, спираль а4 остатки , частично доступная растворителю структура 4 остатки , содержащая гистидин Н8 активного центра, и так называемая петля петля Крп см. Рис.