Исследования внутриклеточных пулов Ca2+ и их роль в сократительной активности миксомицета Physarum polycephalum

• Автор: Кочегаров, Андрей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

1.1. Описание объекта .

1.2. Автоколебания сократительной активности и Са2, в РИуяагит ро1усерИа1ит

1.3. Роль внеклеточного Са2 в генерации автоколебаний .

1.4. Са2 во внутриклеточных органеллах

1.5. Поддержания низкого уровня Са2 в цитоплазме клеток .

1.6. Внутриклеточные Са2каналы .

1.7. Трансмембранный потенциал в РИу.чагит ро1усеркиЫт .

1.8. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .
2.1. Культивирование и подготовка микроплазмодиев для экспериментов
2.2. Окрашивание клеток флуоресцентным Саиндикатором
2.3 Отмывка микроплазмодиев
2.4. Измерение флуоресценции ХТЦ
2.5. Оптическая регистрация сократительной активности
2.6. Измерение Са2 в среде с помощью Са2селективного электрода
2.7. Реактивы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .
3.1. Влияние кальциевого хелатора ТРЕЫ .
3.2. Влияние бескальциевой среды .
3.3. Влияние дигитонина на выход Са2 из плазмодия получение пермебелизованных клеток с помощью дигитонина
3.4. Влияние блокаторов кальциевых каналов плазмалеммы .
Л I Л
3.5 Влияние блокаторов Са АТРаз на выход Са из внутриклеточных пулов и
сократительную активность .
3.6. Стимулирование выхода Са2 из внугриклеточных пулов под влиянием
кальциевого ионофора иономицина .
3.7. Влияние Сб2 на эффект ВНО и иономицина
3.8. Влияние кофеина на выход Са2 из внутриклеточных пулов и на сократительную
активность
3.9. Влияние КС1 на сократительную активность и жизнеспособность микроплазмодиев .
3 Обсуждение результатов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Скорость потока значительно уменьшается или совсем прекращается во время поздней метафазы i, , , что может быть связано с повышением выхода Са2 во время метафазы , . Плазмодий также обладает способностью к миграции при которой происходи Миграция плазмодия осуществляется за счет более мощного или более длительного потока по направлению к фронту. Мигрирующий плазмодий обладает полярностью в передней части тонкие тяжи сливаются образуя сплошной тонкий слой, а в задней части остаются редкие утолщенные тяжи. Скорость передвижения плазмодия составляет 23 смчас иногда до 5 смчас. Установлено наличие градиента концентрации свободного кальция в мигрирующем плазмодии внутриклеточная концентрация Са2 осциллирует во фронтальной области в диапазоне 00 нМ и в хвостовой 00 нМ . Плазмодий выращенный на поверхности фильтровальной бумаги в чашечке Петри на полуопределенной среде не обладает полярностью и не мигрирует в определенном направлении, а равномерно распространятся во все направления. В стерильной питательной среде i i, можно выращивать встряхиваемую суспензию микроплазмодиев, мелких шаровидных объектов около 00 мкм в диаметре, которые также обладают способностью к сократительной активности. При прекращении встряхивания микроплазмодии оседают на дно, прикрепляются к поверхности, распластываются т. i . Установлено, что в процессе морфогенеза в маленьких микроплазмодиях, формирующихся из капель эндоплазмы, возникает обширная система инвагинаций плазмалеммы, представляющая собой составную часть эктоплазмы , . Увеличение поверхности плазмалеммы за счет инвагинаций является адаптивным приспособлением для внеклеточного пищеварения. Люмен системы инвагинаций хотя и остается внеклеточным компартментом, тем ни менее обладает некоторой буферной емкостью к изменению состава внеклеточной среды. Можно предположить, что инвагинации плазмалеммы могут отпочковываться от мембраны и образовывать Сааккумулирующий компартмент, изолированный от внешней среды и от цитоплазмы. Установлено, что обработка микроплазмодиев кофеином 5 мМ ведет к обратимому нарушению способности плазмодия формировать и поддерживать систему инвагинаций, к разбуханию плазмалеммы, к подавлению двигательной активности , I, iii . М , . В кофеиновых капельках сохраняется поток протоплазмы при низком уровне внешнего Са2 I, , , . В отличие от большинства животных клеток в кальциевые колебания существуют постоянно и их генерация не зависит от внешних стимулов. Осцилляции уровня Са2 были обнаружены на плазмодии инъецированном акворином, причем сокращения происходят в регионе с повышенной концентрацией Са2 i , . Осцилляции уровня Са2 наблюдались также на плазмодии инъецированном Са2индикатором 2, причем 2,i, возрастает в фазе сокращения и снижается в фазе расслабления а М с минутным периодом, характерным для колебаний сократительной активности. Колебания уровня Са2 удалось наблюдать, в отдельных случаях, в гомогенате плазмодия i i, . Было показано, что микроиньекция Са2буфера в тяжи плазмодия вызывает усиление силы сокращения при увеличении концентрации свободного Са2 в буфере в диапазоне от 0 до нМ, с величиной насыщения при 0 нМ, и полумаксимальным ответом при 0 нМ . Хотя в некоторых работах, напротив, показываегся ингибиторное влияние Са2 на сокращение изолированных из плазмодия актомиозиновых волокон , i , , в связи с чем выдвигается гипотеза о принципиальном отличии актомиозиновых филаментов от изученных филаментов из других типов клеток. Показано также, что механические колебания кореллируют с изменениями поверхностного . АТР i . и i . Микроиньекция двух последних медиаторов вызывала сокращение тяжа плазмодия, что может указывать на участие этих медиаторов в генерации автоколебаний.