Механизмы работы ключевых элементов систем фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных

• Автор: Орлов, Николай Яковлевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 302 с. : ил.

Содержание

Глава. I. Транслуимн и другие связываюшнс белки. Механизмы их

активации и регулнцни.

1. связывающий белковый комплекс в II сетчатки лягушки

2. связываюишй белок траисдуции компонент молекулярного усилителя НСП сетчатки

3. Скорость диссоциации комплекса тралсдуцин в присутствии обесцвеченного родопсина в НСП сетчатки лягушки. Начальный этап исследований
4. Нуклеозиддифостаткиназная киназная активность препаратов НСП сетчатки лягушки и водорастворимых белков НСП. Светозависимое фосфорнлирование в препаратах НСП

5. киназа в препаратах факторов элонгации i и .

6. Краткое заключение

Глава II. Возможные механизмы регуляции системы фототранслукнии

ионами калышя.

1. Скорость гидролиза в активном центре трансдуцина.
2. Влияют ли ионы кальция на время жизни активного состояния трансдуцина Экспериментальные результаты н предположения
3. Водорастворимые Сасвязывающие белки препаратов НСП сетчатки быка. Белкимишени комплекса Са2кальмодулии
Глава III. Активации и регуляция снецифнчнои фосфодиэстсразы
НСП сетчатки
1. Активация спеиифичной фосфодиэстеразы в препаратах наружных сегментов палочек сетчатки быка трансдуиином в присутствии и его негидролнзуемых аналогов
2. Популяции сиецифичной фосфодиэстеразы НСП сетчатки быка, отличающиеся сродством к фоторецепторным мембранам
3. Возможная роль некаталитичесхнх связываюших центров специфичной фосфодиэстеразы НСП сетчатки позвоночных
Глава IV. сСМРспсиифичная фосфолиэстераза ключевой элемент системы фототранслукнии колбочек сетчатки позвоночных. Сходство и различия систем регуляции активности ФДЭ в палочках и колбочках сетчатки позвоночных.
1 .сОМРспецифичная фосфодиэстсраза ключевой элемент системы фототранслукнии колбочек сетчатки позвоночных До
2.Обсуждение результатов. Принципы фототранслукнии колбочек. Сходство и возможные различия механизмов фототранслукнии
екотопичсской и фотопическон систем зрения позвоночных
Глава V. Измерение времени диссоциации комплекса трансдуцнн в присутствии обесцвеченного родопсина. Исследования гг
1.Введение .
2.Материалы и методы
3.Результат ы.
4.0бсуждеиие результатов .
5.Краткое заключение .
Глава VI. Исследование гг. Изоформспецнфичное взаимодействие киназы с белком фоторецепторов сетчатки позвоночных трансдуцином.
1. Взаимодействие киназы с мембранами обесцвеченных НСП сетчатки крупного рогатого скота. Эффекты , солей и гуаниловых нуклеотидов.
2. Специфичное к изоформам опосредуемое трансдуцином взаимодействие рекомбинантных киназ крысы с мембранами НСП сетчатки быка.
3. Взаимодействие рекомбинантной киназы а крысы с обесцвеченными мембранами НСП сетчатки быка. Возможный механизм влияния и солен.
Глава VII. Физикохимические свойства рекомбинантных аир изоформ
киназы крысы и их производных.
1. Сравнительное исследование рекомбинантных аир изоформ киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции
2. Сравнительное исследование химерных, мутантных и форм киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции.
3. Исследование термостабильности киназ а и 3 и их
производных.
5. Исследование стабильности киназ как гексамеров.
Глава VIII. Заключительное обсуждение.Возможпая функциональная роль
киназ в клетках. Трансфосфорилнрованне связанного .
Выводы
Список лнтерагуры.
Благодарности.
Список основных сокращений
НСП, ИСК наружные сегменты палочек и колбочек сетчатки позвоночных,
соответственно
МДНС мембраны дисков НС
зрительный пигмент НСП сетчатки позвоночных трансмембранный хромопротсин родопсин
фотоактивировалный родопсин
специфичная фосфодиэстераза фоторецепторов сетчатки позвоночных белки гетеротримерные связывающие белки белок НСП сетчатки позвоночных трансдуцин киназа нуклеозиддифосфаткиназа ЕС 2.7.4.6.
киназа а и киназа р рекомбинантные гомогексамерные а и ризоформы киназы крысы, соответственно.
, аденозин и гуанозин 5трифосфат, соответственно
, аденозин и гуанозин 5дифосфат, соответственно
, аденозин и гуанозин 5монофосфат, соответственно
, циклический аденозин и гуанозин 3,5монофосфат, соответственно
негидролизуемый аналог гуанозин 3тиотрифосфат
нсгидролизуемый аналог гуанозин5р,уимииотрифосфат
негидролизуемый аналог АТР аденозин5р,уиминотрифосфат
додецилсульфат натрия
электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие этнлендиаминтетрауксусная кислота
зтиленгликольбис2аминозтилзфир4.4,4,Гтетрауксусная кислота квантовый выход флуоресценции
Хшах положение максимума спектра поглощения или флуоресценции i трисгидроксиметилам ином етан
гндроксиэтил1 пипсразшзтансульфоновая кислота
I изоэлектрическос фокусирование
дитиотрситол
i неорганический фосфат
М.м. молекулярная масса
Введении
Актуальность


Л. Обесцвечивание препарата НСП не меняло значительно температуру денатурации родопсина но значительно уменьшаю энтальпию этого процесса. Одновременно обесцвечивание практически не меняло энтачышю процесса денатурации трансдуцина но значительно на сС уменьшало температуру его плавления Рис. Таким образом, данные, полученные методом микрокалориметрии, дополнительно подтверждают точку зрения о том, степень взаимодействия трансдуцина с фоторецепторной мембраной определяется функциональным состоянием родопсина. Концентрация родопсина в НСП составляет около 5 мМ . Большее значение внутриклеточной концентрации около мМ характеризует лишь гемоглобин в эритроцитах , . Столь высокое значение концентрации , как и определенная ориентация родопсина с помощью мембран дисков по отношению в падающему на сетчатку свету и высокий коэффициент экстннкцни Ем 0 Мсм1 обеспечивают эффективное поглощение света фоторецепторами. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что внутриклеточная концентрация трансдуцина в НСП составляет по порядку величины от концентрации родопенна и, таким образом, может быть оценена величиной около 0. М. Это в десятки и сотни раз превышает концентрацию других связываюших белков, функционирующих в системах клеточной трансдукции. Относительная легкость получения высокоочишснных препаратов НСП в значительных количествах, рекордно высокое содержание в НСП и простота его выделения в очищенном виде сделали трансдушш популярной моделью для изучения принципов функционирования белков этого тина и позволили получить результаты, имеющие обшебиологическое значение. В частности, именно трансдуцин явился первым представителем класса гстсротримерных связывающих белков белки, трехмерная структура которого была расшифрована а. Последуюнше исследования показали, ют эта структура очень близка структурам других белков этого класса см. Отмеченные выше данные , свидетельствовали о том, что трансдуцин в комплексе с и его аналогами играет роль активатора . Эксперименты, выполненные Кюном , , , указывали на то, что такой комплекс образуется в присутствии обесцвеченного родопсина . В таком случае, ранние результаты Ии и Либмана, согласно которым обесцвечивание одной молекулы родопсина в присутствии или его аналогов ведет к активации значительного количества молекул , i, могли означать, что одна молекула родопсина способна привести к формированию большого количества комплексов трансдуцин. Дтя проверки такой возможности мы исследовали связывание негидролизуемого аналога 3 препаратами НСП сетчатки лягушки, полученными из сетчаток животных, тщательно адаптированных к темноте, и препаратами НСП, содержащими различное количество обесцвеченного родопсина. В выбранных нами условиях инкубации препараты НСП, полученные из сетчаток животных, тщательно адаптированных к темноте, практически не связывали 3, однако уровень связывания увеличивался в десятки раз при обесцвечивании всего 1 родопсина в образцах Рис. Максимальный уровень связывания составлял около 3 от молярного содержания родопсина. Это давало основания считать, что связывание обусловлено именно трансдуцином, а обесцвеченный родопсин является катализатором процесса образования комплекса трансдуцин. Последующие эксперименты показали, что уровень связывания 3II зависит от уровня обесцвечивания родопсина в образцах, а максимальный уровень связывания достигается уже при обесцвечивании 0. Одна из типичных зависимостей показана на Рис. Представленные данные показывают, по в диапазоне низких уровней фотолиза родопсина обесцвечивание одной молекулы зрительного пигмента ведет к формированию 0 молекул комплекса 3, и, следонагелыю, к формированию большого количества молекул активатора . Рис 5. Обесцвечивание родопсина индуцирует связывание в препаратах НСП сетчатки лягушки. Лягушек адаптировали к темноте в течение ч при 4С. Получение НСП и последующие измерения уровня связывания 3НОррЫНр были выполнены при слабом красном свете X 0 нм. В момент времени Ну препарат облучали вспышкой света, обесцвечивающего 1 родопсина в образце. Уровень связывания, принятый за 0, составлял 0.