Флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: свойства и использование для обнаружения внутриклеточных липопротеинов в лейкоцитах крови

• Автор: Гуларян, Самвел Кимович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

1.1. История синтеза и первые исследования ДМХ

1.2. Влияние химической структуры молекулы халконов на электронные спектры поглощения

1.3. Влияние химической структуры молекулы на флуоресцентные свойства халконов

1.4. Структура молекулы ДМX

1.5. Спектральные характеристики ДМХ

1.6. Квантовый выход флуоресценции ДМХ

1.7. ДМХ как люминесцентный индикатор

1.8. ДМХ как флуоресцентный зонд для исследования биологических объектов

1.9. Исследования структуры мембран с помощью флуоресцентных зондов

1.9.1. Модель гетерогенных мест связывания зонда в мембране

Кластерная модель структуры мембран

1.9.2. Релаксационная модель структуры липидного бислоя
1.9.3. Модель ТУ1СТ
1 Локализация зондов в липидном Смелое.
Физикохимическая структура мембаиы
1 Флуоресцентный зонд ДМХ в исследованиях липопротеинов и клеток
1 Клеточный состав крови
1 Липидный состав клеток крови
1 Способность клеток крови к синтезу липидов
1 Внутриклеточные липидные частицы клеток крови
ЧАСТЬ 2. Результаты исследований
Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Реактивы и среды
2.2. Приготовление лппосом и липидных шаров
2.3. Выделение липопротеинов
2.4. Выделение клеток
2.4.1. Лимфоциты из тимуса крыс
2.4.2. Лимфоциты из периферической крови человека
2.4.3. Грапулоциты из периферической крови человека
2.5. Субклеточное фракционирование
2.5.1. Сканирующая электронная микроскопия
2.5.2. Трансмиссионная электронная микроскопия
2.6. Аналитические методы
2.6.1. Определение белка
2.6.2. Определение нуклеиновых кислот
2.6.3. Определение фосфолипида
2.7. Флуоресцентные зонды
2.8. Флуоресцентные измерения
2.8.1. Флуоресцентная микроскопия
2.8.2. Регистрация стационарных спектров флуоресценции
2.8.3. Регистрация безызлучательного переноса энергии
2.8.4. Проточная цитофлуоромстрия клеток
2.8.5. Регистрация кинетики затухания флуоресценции
2.9. Спектрофотометрические измерения
2 Измерение фосфоресценции
2.И. Фемтосекундная абсорбционная спектрофотометрия
2 Измерение кондуктометричсского объма клеток
2 Квантовохимпческие расчеты
Глава 2. Создание экспериментальных устпнопок для исследования клеток кропи
2.2.1. Установка для разрушения цитоплазматической мембраны лейкоцитов
2.2.2. Проточный цнтофлуориметр для исследования клеток мембранными флуоресцентными зондами
Глава 3. Исследование оптических свойств ЛМХ
3.1. Квантовохимические расчеты свойств молекулы ДМХ
3.1.1.Квантовохимические расчты и кристаллографическое исследование конформации молекулы ДМХ в основном состоянии
3.1.2. Квантовохимические расчеты электронных переходов в молекуле ДМХ
3.1.3. Дипольиый момент молекулы ДМХ В ОСНОВНОМ СОСТОЯНИИ Рх
3.2. Оптические свойства зонда ДМХ в органических растворителях
3.2.1. Влияние растворителя па положение максимумов спектров поглощения и флуоресценции зонда ДМХ
3.2.2. Дипольиый момент возбужденного состояния молекулы ДМХ
3.2.3. Квантовый выход флуоресценции ДМХ в органических растворителях
3.2.4. Влияние вязкости и дииольиого момента молекулы растворителя на флуоресценцию ДМХ
3.2.5. Влияние полярности среды на динамику процессов релаксации в возбужденном состоянии. Фемтосекундная спектроскопия
3.2.6. Фосфоресценция ДМХ в неполярной и полярной средах
3.2.7. Барьер перехода ДМХ из флуоресцирующего в нефлуоресцирующее состояние
3.2.8. Влияние температуры и полярности среды на спектр поглощения ДМХ
Глава 4. Использование ЛМХ для исслслоппния мипсллярпмх и лпммслярнмх липидных структур п лимНюиитах кропи
4.1. Флуоресценция зонда ДМХ в модельных липидных мембранах липосомах
4.1.1. Спектры флуоресценции ДМХ в мсбранах различного
липидного состава
4.1.2. Определение параметров связывания ДМХ с липосомами
4.1.3. Коэффициенты молярной экстинкцип и квантовый выход флуоресценции ДМХ в липосомах
4.2. Флуоресценция зонда ДМХ в субклеточных органеллах лимфоцитов
4.2.1. Субклеточное фракционирование
4.2.2. Разделение и биохимическая характеристика субклеточных фракций
4.2.3. Морфологическая характеристика выделенных фракции
4.2.4. Связь между интенсивностью флуоресценции ДМХ и биохимическим составом субклеточных фракций
4.3. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах периферической крови человека
4.3.1. Спектры флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах
4.3.2. Проточная цитофлуоромстрия лейкоцитов, окрашенных
зондом ДМХ
4.3.3. Флуоресценция зонда ДМХ в выделенных фракциях лимфоцитов и гранулоцитов
4.3.4. Разложение гистограмм клеток крови па составляющие.
Сравнение результатов разложения сданными гематологического анализа мазков крови
4.3.5. Вклад эритроцитов и тромбоцитов в гистограмму распределения
клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ
4.3.6. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах крови здоровых доноров
4.4. Исследование пространственной структуры липида в лейкоцитах
крови человека методом безызлучателыюго переноса энергии
4.4.1. Перенос энергии между молекулами флуоресцентных зондов
К и ДСП в лимфоцитах
4.4.2. Влияние трансмембранних полей лимфоцита на распределение
зондов К и ДСП в клетке
4.4.3. Влияние зонда К на катионаккумулирующую способность митохондрий лимфоцитов
4.4.4. Исследование пространственной струтуры липида в лейкоцитах по результатам переноса энергии между молекулами флуоресцентных зондов К, ДМХ и ДСП
4.5. Возможные причины различий флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Эти простые эксперименты впервые установили природу полос поглощения ДМХ и показали, какие именно группы участвуют во внутримолекулярном переносе электронов для формирования пика 9 нм необходим перенос электрона с азота в ароматическую систему, а ослабление двойной связи С0 приводит к длинноволновому сдвигу спектра 5. С года по год было опубликовано несколько экспериментальных работ и обзоров 9, авторы которых исследовали связь между структурой молекул халкоиов и их производных, в том числе и ДМХ, и спектрами поглощения. Интерпретируя длинноволновую полосу поглощения в терминах теории резонанса, и предложили для основного состояния молекулы трансхал кона граничную структуру I рис. Рис. Формы трансхалкона. Первый Бо 1, наиболее длинноволновый переход соответствует поглощению халкона с максимумом в области 0 0 см1 и относится к переходу типа пя. Второй, третий и четвертый переходы относятся, по мнению авторов, к лл переходам и находятся в областях 0 см1, 0 см1 и 0 см соответственно. По расчетным и экспериментальным данным авторы относят второй переход к внутримолекулярному переносу заряда 0, с с кольца А рис. Таким образом, это возбужденное состояние соответствует структуре И, предложенной в 7. Четвертым переход также связан со значительным 0, с переносом заряда на пропсноновую группировку атомов, но уже с кольца В. Как считают авторы, первый и третий переходы существуют, по не наблюдаются в явной форме в экспериментах вследствие их перекрывания с более интенсивными полосами поглощения переходов 2 н 4. Экспериментальные данные, приведенные в работе , показывают, что при переходе от неполярного растворителя ноктан к полярному этанол в электронноколебательном спектре поглощения халкоиа исчезает полоса пл перехода, а наиболее интенсивная полоса, связанная со вторым переходом, сдвигается в длинноволновую область на нм. Исследовалась также природа второго коротковолнового перехода халкоиа. В 9 было показано что, ультрафиолетовая полоса поглощения характерна для цнеконформеров халконов. Мем и 5 8 М ем 1. Авторы также показали, что скорость трансцнс фотоизомеризации сильно зависит от природы растворителя и в некоторых случаях может завершаться за нескольких минут или даже секунд. Особый интерес исследователи проявляли к изучению спектральных свойств замещенных халконов. Эти работы позволили обнаружить некоторые закономерности электроииовозбужденых состояний для всего семейства соединений. По влиянию на спектр они раздели производные халкоиа на две группы соединения с заместителями в кольце А и в кольце В см. Авторы отмечают, что при введении сильных элсктроидопориых заместителей в кольцо А наблюдается длинноволновый сдвиг первого лл перехода. При этом величина сдвига примерно в 2 раза выше, чем, в случае, если заместитель вводится в кольцо В. Интересно, что самый большой длинноволновый сдвиг наблюдался для молекулы ДМХ он составил нм от максимума поглощения траисхалкона 2 им. Влияние химической структуры молекулы иа флуоресцентные свойства халкоиов. Люминесцентные свойства ДМХ были впервые обнаружены и описаны в году С. В. Цуксрманом в Харькове . По мнению Л. Д.Паценкера личное сообщение, основанному на аналогии ДМХ с другими флуоресцирующими молекулами, наличие флуоресценции у халкоиов обусловлено несколькими причинами, связанными между собой. Вопервых, необходимым условием является наличие электронных переходов с внутримолекулярным переносом заряда ВПЗ. Эти переходы сопровождаются происходящим при оптическом возбуждении перераспределением электронной плотности между двумя более или менее обособленными электронными системами в пределах одной и той же молекулы. Иными словами, происходит перенос электронов с орбиталей одной локальной системы, выступающей в роли донора, на орбитали другой системы группировки, играющей роль акцептора. Вторым обязательным условием люминесценции считают наличие между донорноакцепторпымн группами цепи сопряжения, которая должна быть представлена несколькими ясвязями. В случае ДМХ роли донора и акцептора электронов выполняют димстиламнногруппа и карбонильная группа, соответственно. Структура молекулы 4дн. Рис. Структура молекулы ДМХ, рассчитанная по данным рентгеновской кристаллографии. Приведены эллипсоиды температурного колебания атомов при температуре 0С 8 9.