Изучение механизма генерации супероксид-аниона в интрактных митохондриях в присутствии люцигенина

• Автор: Круглов, Алексей Георгиевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 183 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Механизмы генерации супероксиданиона СА в митохондриях. Роль СА в повреждении митохондрий и клеток
1.1. Митохондрии как один из основных источников активных форм кислорода АФК в клетках. Скорость образования АФК в различных препаратах митохондрий, измеренная с использованием ферментных и химических методов

1.2. Идентификация СА в качестве предшественника гидроперекиси в митохондриях

1.3. Механизмы генерации СА в митохондриях

1.4. Механизмы генерации СА в митохондриях, индуцированной рсдоксактивными соединениями
Глава 2. Механизмы регуляции уровня С А митохондриями и их физиологическое значение в защите клеток от окислительного стресса

2.1. Регуляция скорости генерации СА в дыхательной цепи сопряженных митохондрий

2.1.1. Особенности генерации АФК СА в митохондриях в присутствии различных субстратов окисления
2.1.2. Потенциалзависимость генерации СА в митохондриях
2.1.3. Гипотеза о роли потсициалзависимых изменений скорости генерации С А в митохондриях в защите клеток от окислительного стресса
2.2. Основные реакции утилизации СА в митохондриях
2.3. Мишени и механизмы повреждающего действия АФК в митохондриях и клетках
Глава 3. Методологические проблемы регистрации С А в митохондриальных препаратах с помощью химических ловушек и ферментных методов
3.1. Компартментализация и кинетические характеристики основных реакций образования и превращений СА в митохондриях
3.2. Особенности применения современных методов количественной
иили качественной оценки скорости генерации СА в митохондриях
3.2.1. Ферментативные и химические методы косвенной регистрации образования СА по накоплению гидропероксида
3.2.2. Методы прямой регистрации СА с помощью химических ловушек
3.2.2.1. Требования, предъявляемые к системе детектирования СА в митохондриях
3.2.2.2. Кинетические характеристики реакций взаимодействия химических ловушек с СА в гомогенных водных химических и ферментативных системах
3.2.2.3. Анализ возможностей и ограничений применения химических ловушек для регистрации СА в митохондриальных системах
3.3. Обоснование выбора люцигенина для регистрации образования СА в интактных митохондриях МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Химические препараты и биологические объекты, использовавшиеся в экспериментах
2. Выделение митохондрий из печени крыс
3. Методика проведения экспериментов РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Люцигенинзависимая хемилюминесценция ЛЗХ в интактных митохондриях
1.1. Исследование лимитирующих стадий и локализации реакций генерации ЛЗХ в интактных митохондриях печени с помощью ингибиторного анализа
1.1.1. Кинетика ЛЗХ в митохондриях и ферментной системе, содержащей ксантиноксидазу, в присутствии различных концентраций люцигенина
1.1.2. Зависимость накопления и распределения люцигенина в митохондриях от его концен грации в среде инкубации
1.1.3. Влияние ингибиторов дыхательной цепи митохондрий на генерацию ЛЗХ
1.2. Корреляция изменений ЛЗХ и степени восстановленности компонентов дыхательной цепи при прямом и обратном переносе
электронов в условиях постоянных или меняющихся значений Дф
1.2.1. ЛЗХ в митохондриях, окисляющих различные субстраты
дыхания
1.2.2. Влияние степени восстановленности никотинамидньтх нуклеотидов на уровень ЛЗХ в условиях индукции обратного
переноса электронов
1.2.3. Быстрые обратимые и необратимые изменения ЛЗХ в митохондриях при различных функциональных нагрузках в присутствии высоких концентраций люцигенина
1.3. Схема предполагаемого механизма генерации ЛЗХ в комплексе III 1 Глава 2. Механизм люцигенинзависимой генерации СА в интактных митохондриях в условиях максимального восстановления компонентов дыхательной цепи цианидом
2.1. Выбор условий регистрации цианидрезистентното дыхания и ЛЗХ
2.2.Цианидрезистснтное дыхание митохондрий, индуцированное люцигенином
2.2.1. Влияние начального состояния митохондрий и изменений величины трансмембранного потенциала на кинетику цианидрезистентного дыхания
2.2.2. Действие ингибиторов дыхательной цепи на цианидрезистентное дыхание
2.3. Люцигенинзависимая хемилюминесценция и регистрация
изменений величины трансмембранного потенциала
2.3.1. Зависимость процесса генерации ЛЗХ от изменений трансмембранного потенциала
2.3.2. Механизмы увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий в условиях высокой скорости образования С А
2.3.3. Действие ингибиторов дыхательной цепи на ЛЗХ
2.4. Качественные различия в механизмах индукции цианидрезистеитно1 о дыхания и ЛЗХ и их возможные причины
Глава 3. Исследование механизмов и регуляции повреждающего действия люцигенина и других редоксактивных соединениий енераторов СА на изолированных митохондриях и в клеточных системах
3.1. Индукция люцигенином открывания Са2зависимой неселективной поры во внутренней мембране митохондрий
3.2. Корреляция изменений ЛЗХ и величины кальциевой емкости митохондрий, окисляющих различные субстраты в присутствии низких
концентраций менадиона
3.3. САзависимое повреждение мембраны митохондрий дигидролипосвой кислотой
3.4. Цитостатическое и цитотоксическое действие люцигенина
3.5. Использование приема регистрации кинетических характеристик ЛЗХ для оценки изменений скорости генерации СА и ионной проницаемости мембраны митохондрий, индуцированных прооксидантами
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


К., , в своей работе они использовали СМЧ, предварительно отмытые от СОД. Было показано, что в СМЧ в присутствии сукцината и антимицина А супероксиданион является предшественником гидроперекиси, но не наоборот. Каденас и Боверис одновременно с Диониси и др. СА и гидроперекиси, которое оказалось близким к 2 vi . О., . СА и продуктов его спонтанных и ферментативных превращений. Многим исследователям не удалось измерить образование СА в СМЧ, если те не были предварительно отмыты от МпСОД , М. С., , vi . Эти исследования позволяют заключить, что данные регистрации образования гидроперекиси в интактных митохондриях отражают не только скорость продукции СА, но и скорость его дисмутации и разложения гидроперекиси каталазой, а также скорость диффузии гидроперекиси к местам взаимодействия с зондами. Поэтому, для понимания механизмов регуляции образования СА в интактных митохондриях наиболее корректным является непосредственное изучение образования супероксиданиона в точках его естественной генерации. Следует отмстить, что данные о скорости генерации или уровне СА в интактных митохондриях в различных физиологических условиях очень ограничены, и, как правило, получены с использованием ЭПР методов, что затрудняет их количественную интерпретацию v , , Коркина и Руугс Э. К., или гидроэтидина, имеющего ряд существенных ограничений i V, , . Возможность генерации в митохондриях в физиологических условиях периодически ставится под сомнение Н. Изучение механизмов генерации СА в митохондриях было начато группами Лошена и Чанса, применившими метод ингибиторного анализа для локализации пунктов образования СА в дыхательной цепи . В. vi . В настоящее время точно установлены 2 основных участка генерации супероксиданиона комплекс I и комплекс III электрон транспортной цепи рис. Обсуждается также возможность образования супероксиданиона в комплексе И. Наиболее хорошо изучен механизм образования супероксиданиона в комплексе III. Группами Лошена и Чанса было обнаружено, что антибиотик антимицин А, подавляющий перенос электронов на уровне комплекса III дыхательной цепи митохондрий, мощно стимулирует продукцию гидроперекиси в присутствии сукцината или глутамата с манатом в качестве субстратов окисления . В. vi . В то же время блокирование потока электронов от комплексов I и II к комплексу III ингибиторами начальных участков дыхательной цепи подавляет продукцию гидроперекиси в митохондриях В. Одновременно было показано участие убихинона, осуществляющего перенос электронов между дегидрогеназами и комплексом III в генерации СА. Так, экстракция убихинона приводила к подавлению, а встраивание к восстановлению продукции АФК В. Причем, для эффективной продукции СА необходимо не только восстановление убихинона до убихинола, но и его последующее одноэлектронное окисление цитохромом С Е. Рис. Схема путей переноса электронов и мест генерации супероксиданиона в дыхательной цепи митохондрий. СА и гидроперекиси . Эти данные позволили заключить, что донором электрона при одноэлекгронном восстановлении кислорода является убисемихинон, образующийся при работе комплекса III vi . Предложенная Митчелом гипотеза об организации переноса электронов между убихинолом и цитохромами и с в комплексе III гипотеза цикла, i М. К. . Риске . Р iiv связывания убихинола. В результате один электрон переносится кластером Риске на цитохром С и далее на цитохромы с и ааз. Одновременно с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий освобождаются два протона. Второй электрон по цени цитохромов Ьц возвращается к внутренней поверхности внутренней мембраны, где взаимодействует со связанным в ТЧцентре убихиноном, и после образования убихинола в результате второго одноэлектронного восстановления может быть вновь использован для транспорта протонов. Исходя из представлений о функционировании цикла, легко объяснить действие ингибиторов дыхательной цепи на величину продукции СА. Аитимицин А см. СА Е. Миксотиазол, связывающийся с оцентром ближе к гему цитохрома i и препятствующий окислению убихинола i , .