Взаимодействие цитохрома C и активных форм кислорода

• Автор: Переверзев, Михаил Олегович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил

Содержание.

ВВЕДЕНИЕ. ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Активные формы кислорода.

Действие АФК.

Образование и превращения АФК.

Участки образования А ФК в митохондриях.

Защита от активных форм кислорода.

Ферменты.

Низкомолекулярные антиоксиданты.

Эшелоны защиты от А ФК.

Краткие выводы по разделу активные формы кислорода.

Некоторые методы регистрации активных форм кислорода.
Регистрация супероксида.
Регистрация НуО
Регистрация ОН и 2
Измерение Н2О2 с помощью скополетина и пероксидазы хрена
Цитохром с.
Структура цитохрома с.
Электронтранспортная функция цитохрома с.
Участие цитохрома с в апоптозе.
Цитохром с и активные формы кислорода.
Пероксидаза хрена.
Общая информация.
Механизм катачизируемых реакций.
Характеристика соединений пероксидазы хрена. Взаимодействие пероксидазы хрена и цитохрома с.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Выделение митохондрий из сердца крыс.
Выделение субмитохондрнальных частиц из митохондрий сердца быка.
Приготовление липосом.
Приготовление липосом со встроенной цитохромоксидазой. Измерение скорости восстановления цитохрома с супероксидом. Наблюдение реакции обратного транспорта электронов.
Измерение скорости образования Н2О2 митохондриями.
Измерение скорости образования Оз субмитохондриальными частицами.
Измерение потенциала на мембране липосом.
Обработка результатов эксперимента.
Реактивы.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Восстановление цитохрома с супероксидом в присутствии азолектиновых липосом.
Генерация потенциала на мембране протеолипосом с цитохромоксидазой при окислении цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.
Генерация Н2О2 митохондриями сердца крыс.
Генерация О2 субмитохондриальными частицами из митохондрий сердца быка.
Окисление цитохрома с перекисью водорода, катализируемое пероксндазой хрена.
Влияние цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями. ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Восстановление цитохрома с супероксидом в присутствии азолектиновых ЛИПОСОМ.
Генерация потенциала на мембране протеолипосом с цитохромоксидазой при окислении цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом.
Генерация Н2О2 митохондриями сердца крыс.
Генерация О2 субмитохондриальными частицами из митохондрий сердца быка.
Влияние цитохромов с на генерацию Н2Ог митохондриями.
Окисление цитохрома с перекисью водорода, катализируемое пероксндазой хрена.
Влияние мутированных цитохромов с на генерацию Н2О2 митохондриями.
выводы.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ. БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Скулачева цит с также рассмотрен в качестве эффективного перехватчика О2 в межмембранном пространстве митохондрий. Вообще, есть основания полагать, что цит с может является основным перехватчиком О2 в межмембранном пространстве, если учесть, что супероксид дисмутаза СОД обнаруживается в межмембранном пространстве митохондрий лишь некоторых видов тканей и организмов ,9. По данным Дж. Формана и А. Ацци концентрация цит с в межмембранном пространстве колеблется в пределах 0 55 мМ. Н2О2, но и проникнуть за пределы внешней митохондриальной мембраны, как показано, например, в работе Хана и соавторов . В то же время, Ради и др. Таким образом, в настоящее время нет четкого понимания, какую именно роль играет цит с межмембраиного пространства митохондрий в утилизации АФК, генерируемых митохондриями. Каким образом взаимодействует цит с, расположенный снаружи митохондрий высвобожденный из межмембранного пространства в результате апоптоза с АФК, генерируемыми митохондриями, также неизвестно. Целью настоящей работы было определение роли цит с в системе антиоксидантной защиты митохондрий. Была поставлена задача исследовать характеристики взаимодействия цит с и АФК в межмембранном пространстве и снаружи митохондрий. Также было запланировано провести исследование новых мутированных типов цитохромов с не вызывающих апоптоз по способности воздействовать на генерируемые митохондриями АФК с целью установить связь между способностью цит с вызывать апоптоз и характеристиками его действия на АФК. Определение степени вовлеченности цит с в процессы утилизации АФК, генерируемых митохондриями, позволит лучше понять причины проявления токсичного действия АФК и пути предотвращения этого действия. Для описания характеристик взаимодействия цит с и супероксида в мемжмембранном пространстве митохондрий мы выбрали модель азолектиновых липосом Была поставлена задача ответить на два вопроса способен ли цит с, связанный с липидной мембраной, окислять супероксид и происходит ли генерация потенциала на липидной мембране протеолипосом при окислении цитохромоксидазой этих протеолипосом цитохрома с, восстанавливаемого супероксидом. Ог является гидрофильным ионом, а гем цит с, сорбированного на мембране, обращн в сторону липидного бислоя , поэтому вероятно, что только растворнный в воде, но не связанный на мембране цит с, способен окислять супероксид. Таким образом, становится ясно, что не только общая концентрация цит с в межмембранном пространстве, но и состояние цит с связан на мембране или растворн в воде, должно определять его способность утилизировать генерируемый митохондриями супероксид. Образуется ли в результате окисления митохондриальной цитохромоксидазой восстановленного супероксидом цитохрома с достаточный для поддержания синтеза АТФ трансмембранный потенциал или скорость электронного переноса в этом случае слишком мала, чтобы компенсировать утечку Н через внутреннюю митохондриальную мембрану Такая уечка может быть вызвана самим О2 за счт Ог7 НОг антипорта 1, активации разобщающих белков или повреждения мембранных липидов и белков . К. Майлер в году экспериментально продемонстрировала синтез АТФ митохондриями сердца крыс, запускаемый добавкой ксантина и ксантиноксидазы . Однако, некоторые факты из исследования Майлер не позволяли однозначно утверждать, что синтез АТФ осуществляется именно в результате переноса электронов от О2 на цит с и последующего окисления цит с цитохромоксидазой с генерацией ДДн . Поэтому для ответа на поставленный вопрос требовалось проведение дополнительных экспериментов. Проведнное нами в данной работе исследование с использованием простейшей модельной системы, а именно протеолипосом со встроенной цитохромоксидазой, показало, что система цит с и Ог может служить донором электронов для цитохромоксидазы и поддерживать генерацию АД . При исследованиях действия внемитохондриального цит с на генерируемые митохондриями АФК мы показали, что добавляемый к митохондриям цит с в субмикромолярных концентрациях ингибирует генерацию Н2О2, связанную реакцией обратного транспорта электронов .