Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации

• Автор: Дмитриева, Евгения Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Оглавление

2. Материалы и методы

2.1. Объект исследования

2.2. Подготовка животного к опыту

2.3. Замораживаниеоттаивание изолированного мозга

моллюска

2.4. Люминесцентная микроскопия

2.5. Исследование ультраструктуры

2.6. Культура i vi

3. Результаты и обсуждение

3.1. Замораживание изолированного мозга прудовика

до 6С и электрофизиологический контроль
жизнеспособности нейронов после оттаивания
3.2. Изменение функциональной активности нейронов
моллюска люминесцентная микроскопия
3.2.1. Изменение функционального состояния синтетического аппарата нейронов моллюска i . при повышении температуры среды обитания от С до С
3.2.2. Изучение изменения функциональной
активности нейронов моллюска после
криоконсервации
3.2.3. Люминесцентная микроскопия изолированного мозга при длительном инкубировании при 4 ,6Сконтроль
3.2.4. Изменение функционального состояния
синтетического аппарата по параметру а нейронов изолированного мозга моллюска при изменении температуры инкубирования
изолированного мозга
3.3. Изучение изменений ультраструктуры нейрона МПЗ
мозга моллюска после криоконсервации
3.3.1. Ультраструктура контрольных нейронов
3.3.2. Изучение изменений ультраструктурной организации эндоплазматического ретикулума после воздействий замораживанияоттаивания, ДМСО и последующих охлаждения от С до С и длительного инкубирования в физиологическом растворе при С в сравнении
3.3.3. Изучение изменений ультраструктурной организации диктиосом комплекса Гольджи после воздействий замораживанияоттаивания, ДМСО и последующих охлаждения от С до С и длительного инкубирования в физиологическом растворе при С в сравнении
3.3.4. Изучение изменений ультраструктурной
организации митохондрий после воздействий замораживанияоттаивания, ДМСО и последующих охлаждения от С до С и длительного инкубирования в
физиологическом растворе при С в
сравнении
3.3.5. Изучение изменений ультраструктурной
организации ядерной оболочки нейронов после воздействий замораживанияоттаивания,
ДМСО и последующих охлаждения от С до С и длительного инкубирования в физиологическом растворе при С в
сравнении
4. Исследование поведения в культуре i vi нейронов
криоконсервированного мозга моллюска i
Заключение Выводы Приложение Список литературы
Список сокращений
АО акридиновый оранжевый Г гранулы
Гэр гладкий эндоплазматический ретикулум ДМСО диметилсульфоксид КГ комплекс Гольджи Л л изосома
ЛПГ гранулы липофусцина ЛС ламеллярные структуры МвТмультивсзикулярное тельце М митохондрии НК нуклеиновые кислоты РНК рибонуклеиновая кислота РНП рибонуклеопротеин рРНК рибосомальная РНК СлТ слоистое тельце СлП сложные пузырьки
Шэр шероховатый эндоплазматический ретикулум Я ядро 3 закрытая пора, О открытая ЯП ядерная пора
Введение


В то же время работ по исследованию последствий криоконсервации на внутриклеточные структурные и метаболические свойства нейронов незначительное число, закономерности репарации клеточных структур после низкотемпературного воздействия до настоящего времени окончательно не выяснены и требуют дальнейших исследований. В этой связи комплексное изучение морфофункциональных свойств нейронов на модельных объектах например, нейронах беспозвоночных представляется весьма актуальной задачей, поскольку это позволит не только определить области криоповреждений и в значительной степени прогнозировать степень восстановления, но и оценить возможности повышения криорезистентности нейронов с помощью модификации криопротектирующих сред. Целью данной работы было изучить восстановление структуры и функции нервных клеток после криоконсервации на примере идентифицированных нейронов МП1 и МПЗ изолированного мозга моллюска i . Выяснить характер повреждений и нормализации структуры и функции нейронов после замораживанияоттаивания методами электронной и люминесцентной микроскопии. Криоконсервация обратимая остановка жизнедеятельности каеток На сегодняшний день криоконсервирование замораживание и сохранение при сверхнизких температурах, 6С единственный известный метод, способный обеспечить сохранение клеток и тканей животных и растений в течение многих месяцев и даже лет без значительной потери жизнеспособности. Поскольку при столь низких температурах биохимические реакции, необходимые для жизни, не протекают, то клетки ткани, органы, организмы находятся в состоянии временной обратимой остановки жизни жизнедеятельности, или анабиоза ЛозинаЛозинский, , Голдовский, , Ушатинская, . При хранении биологического материала при 6С единственным известным на сегодня повреждающим фактором является радиоактивный фон Земли и космические излучения. Расчеты, полученные на основании экстраполяции экспериментальных данных по действию радиации на клетки при низких температурах, показывают, что они могут храниться при 6С по крайней мере в течение нескольких сотен лет без накопления летальных повреждений ДНК Виленчик, . Согласно современным представлениям основной причиной повреждений клетки при замораживании является образование вне и внутриклеточного льда. При вымораживании воды в лед живые системы подвергаются воздействию комплекса физикохимических факторов. Среди них существенное значение имеют внутриклеточная кристаллизация, гиперконцентрация солей и ионной силы раствора, изменение величины и зарядовых характеристик мембран, значительное обезвоживание и фазовые превращения биополимеров и надмолекулярных структур Пушкарь и др. Белоус, Грищенко, . Процесс кристаллообразования поразному воздействует на клетки и ткани. Подготовка объекта к замораживанию получение биологического материала, погружение в искусственную физиологическую среду и выдерживание в ней для адаптации. Длительность инкубирования и температурные условия зависят от конкретного объекта и поставленных задач. Замещение физиологической среды на криозащитный раствор, который может содержать один криопротектор, или сочетание нескольких криопротекторов, метаболические вещества, антиоксиданты и др. Обычно этот раствор гипсртоничен по отношению к клетке, поэтому криопротектор добавляют постепенно до конечных концентраций. Время выдерживания в этом растворе для осмотического уравновешивания внутриклеточной среды с криозащитным раствором может колебаться от нескольких минут до нескольких часов при постоянной температуре. Глубокое охлаждение до температуры жидкого азота, 6С. Это может быть замораживание путем непосредственного погружения биологического материала в жидкий азот, или замораживание в парах жидкого азота, или по определенной программе с применением специальных замораживающих устройств. Длительное сохранение биологического материала в жидком азоте 6С, или в парах жидкого азота 0н0С в специальных хранилищах. Отогрев объекта по определенному режиму до положительных температур. Отмывка криозащитного раствора и замещение его физиологической средой.