Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях биологически активных соединений

• Автор: Феофанов, Алексей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 252 с. : ил.

Введение

Глава I. Мнкроспектральные исследования БАС Современное состояние проблемы

1.1. Методы исследования БАС на основе микроскопии и флуоресценции

1.2. Микроспектрофлуоримезры

1.3. Развитие метода МСФ и его применения

1.3.1. Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ

1.3.1.1. МСФисследования полициклических ароматических углеводородов ПАУ

1.3.1.2. МСФ в исследованиях лекарств против псориаза

1.3.1.3. МСФ в исследованиях противоопухолевых соединений

1.3.2. МСФ в измерениях внутриклеточных концентраций свободных ионов кальция и магния

1.3.3. Метод МСФ в исследованиях ФС

1.3.4. Анализ методом МСФ собственной флуоресценции клеток
1.3.5. Некоторые другие исследования с применением метода МСФ
Глава II. Приборное обеспечение и разработка метода КОМИРСИ
.1. Приборное обеспечение для конфокальной сканирующей микроспектроскопии
II. 1.1. Конфокальный сканирующий микроспсктромстр фирмы ОПог
II. 1.1.1. Спектрометр
II. 1.1.2. Микроскоп
II. 1.1.3. Входная конфокальная камера и принцип линейного сканирования
II. 1.1.4. Программное обеспечение
II. 1.2. Разработка лабораторной экспериментальной установки для конфокальной
сканирующей микроспектроскопии
.2. Разработка метода КОМИРСИ
.2.1. Идентификация и изучение молекулярных взаимодействий БАС в живых
клетках методом КОМИРСИ
Н.2.2. Проблема собственной клеточной флуоресценции и се решение методом
КОМИРСИ
Н.2.3. Измерение концентрации БАС и их комплексов в живых клетках методом
КОМИРСИ
II.2.4. Применение метода КОМИРСИ для выявления органоидов, в которых
происходит преимущественное накопление исследуемых БАС
И.2.5. Исследования распределения БАС в срезах тканей методом КОМИРСИ
II.2.6. Преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БЛС
Глава III. Материалы и методики
III. 1. Реактивы
III.2. Исследование молекулярных взаимодействий БАС в растворах
III. 3. Измерение генерации активных форм кислорода
1.4. Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ
1.5. Эксперименты на культуре клеток
1.6. Методики, применявшиеся при изучении внутриклеточной локализации БАС
1.7. Методики исследования цитотоксического воздействия БАС
1.8. Приготовление криостатных срезов тканей
1.9. Приборное и программное обеспечение экспериментов
Глава IV. Исследования БАС с применением метода КОМИРСИ
IV Исследования митоксантрона
IV.1 Л. Исследование молекулярных взаимодействий МИТО в растворах
IV. 1.2. Анализ внутриклеточных спектров МИТО
IV. 1.3. Количественный анализ МИТО и его комплексов в клетках К2
IV. 1.4. Особенности внутриклеточного накопления и распределения МИТО на
разных стадиях клеточного цикла
IV. 1.5. Особенности накопления и распределения МИТО в клетках 2 с
множественной лекарственной устойчивостью
IV.2. Исследование сульфированного фталоцианина в живых клетках и срезах
IV.2.1. Молекулярные свойства сульфированного фталоцианина
IV.2.2. Накопление и распределение .4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности
IV.2.3. Распределение .4 в опухолевых тканях
IV.2.3.1. Гистологичсский анализ особенностей роста опухолей
IV.2.3.2. Распределение .4 в срезах тканей
IV.3. Сравнительное исследование свойств ФС хлоринового ряда
1V.3.1. Исследования ЗдезвииилЗформилхлорина рб
IV.3.1.1. Молекулярные свойства ФХрб
IV.3.1.2. Исследования ФХрб в живых клетках
IV.3.2. Циклоимидные производные хлорина рб ЦИХЛ
IV.3.2.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИХЛ
1У.3.2.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ в растворах
1У.3.2.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ
1У.3.2.4. Особенности внутриклеточных спектров флуоресценции ЦИХЛ
1У.3.2.5. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ
1У.3.2.6. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИХЛ
1У.3.2.7. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со
свойствами ЦИХЛ
1У.3.2.8. Механизмы ЦИХЛопосредованной фотоиндуцированной гибели клеток 6 1У.3.2.9. Распределение ЦИХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р8
1У.3.2 ФДТ с использованием соединений 1 и 5
1У.3.2 Сравнительный анализ данных метода КОМИРСИ о распределении
ЦИХЛ в тканях и результатов ФДТ
1У.4. Исследование свойств фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных
производных бактериохлорина
1У.4.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИБХЛ
1У.4.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИБХЛ в растворах
1У.4.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИБХЛ
1У.4.4. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИБХЛ
1У.4.5. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИБХЛ
1У.4.6. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со
свойствами ЦИБХЛ
1У.4.7. Влияние ЦИБХЛопосредованного фотодинамического воздействия на
состояние митохондрий, лизосом и липидного транспорта
1У.4.8. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р8
Заключение
Выводы
Благодарности
Список использованных сокращений
Список литературы


Кинетические измерения выполнялись путем повторного измерения спектров в тех же точках зонах через заданные промежутки времени. Статистическая достоверность исследований достигалась проведением измерений на ограниченной выборке клеток. Флуоресцентные изображения распределения ксенобиотиков в клетках регистрировали на основе интегрального сигнала, спектральный анализ изза технических ограничений того времени для измерения изображений не использовался. Справедливости ради, надо отметить, что еще на начальном этапе развития флуоресцентной микроскопии е годы прошлого столетия предпринимались успешные попытки использовать спектральный анализ в сочетании с микроскопией для изучения тканевого распределения некоторых канцерогенов. Так Меллорс и Глинка использовали метод МСФ для обнаружения канцерогенного рнафтиламнна в клетках слизистой мочевого пузыря и даже характеризовали профиль распределения рнафтиламина в ткани, показав с привлечением спектрального анализа, что характеристичная флуоресценция этого соединения простирается от наружного до внутреннего или базального слоя слизистой . Спектры и профили их распределения они регистрировали фотографическим методом. Одно направление фотопластины использовали для развертки спектров, а вдоль другого проецировали спектры от разных областей исследуемого объекта Рис. С помощью МСФ было показано, что бензоапирен ВаРуг накапливается в цитоплазме клеток Ь и ВЬ, а при дпительных временах инкубации его флуоресценция наблюдается и в ядре . ВаРуг способен в процессе метаболизма образовывать более различных производных. Анализ спектров флуоресценции ВаРуг в живых клетках первоначально привел исследователей к выводу, что форма и максимумы внутриклеточного спектра больше соответствуют 3гидроксибензоапирену, чем ВаРуг . Это было воспринято, как успешная демонстрация возможности исследования метаболизма ПАУ в живых клетках. ВаРуг в растворе, хотя и с некоторыми отличиями . Наличие сигнала продуктов метаболизма удалось обнаружить в общем спектре живых фибробластов 2, проинкубированных с ВаРуг. Спектры этих клеток являлись суперпозицией сигналов собственной клеточной флуоресценции, ВаРуг и двух метаболитов 3гидроксн бензоапирена и 9гидрокси бензоапнрена . В отличие от фибробластов 2, спектр фибробластов ЗТЗ был простой суперпозицией сигналов собственной клеточной флуоресценции и ВаРуг , что указывает на вариабельность интенсивности метаболизма ВаРуг в разных клетках. Методом МСФ были исследованы отличия в скорости детоксификации фибробластов ЗТЗ, обработанных ВаРуг и дибензос, Ьакридином . Измерялась кинетика убывания внутриклеточной флуоресценции изучаемых ПАУ, которую приписывали действию системы клеточных многофункциональных оксидаз ixi xi, даже не обсуждая возможного вклада процессов выведения ПАУ из клеток без их химической модификации. Измерения, проведенные в отдельных клетках, анализировались по выборке из нескольких десятков клеток. Было показано, что кинетики детоксификации сходны для ВаРуг и дибензос, Ьакридина оба соединения относятся к группе гетероциклических ароматических углеводородов. Так как эти два соединения, введенные в клетки совместно, вызывали взаимное конкурентное ингибирование кинетик убывания флуоресценции, сделан вывод об общей для обоих ПАУ системе детоксификации. Присутствие в клетках 6аминохризена, представителя ароматических аминов, блокировало детоксификацию дибензос,Ьакридина по принципу всеилиничего, свидетельствуя, по мнению авторов, о независимой системе детоксификации для 6аминохризена, активацияфункционирование которой блокирует активацию системы ферментов, участвующих в метаболизме дибензос, Цакридина. Кинетика клеточного накопления и метаболизма ВаРуг была успешна исследована методом МСФ в клетках Т карциномы груди человека, которые характеризуются высоким метаболизмом в отношении ПАУ . В качестве источника возбуждения использовали ртутную лампу, из спектра которой с помощью интерференционного фильтра выделяли полосу нм и через объектив микроскопа i V Германия освещали область на образце диаметром 6 мкм.