ДНК-белковое узнавание : Анализ первич. структур и физ.-хим. излучение

• Автор: Полозов, Роберт Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Оглавление
Введение.
Глава 1. Анализ первичных структур промоторов,
терминаторов и кодирующих участков генома E.coli:
статистический анализ, Фурье-спектры и классификация
Глава 2. Анализ первичных структур промоторов,
терминаторов и кодирующих участков генома E.coli: вейвлет-
спектры, фрактальные свойства
Глава 3. Определение первичной структуры биополимеров по ее перекрывающимся фрагментам
Глава 4. Зависимость вторичной структуры ДНК от первичной: неплоское строение аминозамещенных азотистых
оснований и уотсон-криковских пар
Глава 5. Гидратация двойной спирали ДНК: атом-атомные корреляционные функции
Глава 6. ДНК-белковые взаимодействия: комплекс сигма 70 субъединицы РНК-полимеразы с промотором
Глава 7. Электростатические потенциалы ДНК, регуляторных белков и РНК-полимеразы
Выводы
Список литературы

Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Биолог сталкивается с проблемой специфических биологических реакций практически в любой своей деятельности. Специфические биологические реакции присущи многим процессам жизнедеятельности, от взаимодействий между ферментами и субстратами , между гормонами и их рецепторами, между антителами и антигенами, и вплоть до взаимодействий между клетками. Природа использует механизмы молекулярного узнавания генной экспрессии для того, чтобы достигнуть селективности, необходимой в естественном отборе. РНК-, ДНК-полимеразы, топоизомеразы, другие ферменты и регуляторные белки узнают и преимущественно связываются с вполне определенными нуклеотидными последовательностями ДНК генома, различая их среди большого числа других нуклеотидных последовательностей. Эти специфические первичные структуры отбирались в процессе эволюции, чтобы удовлетворить требованию функционально адекватного уровня связывания.
Специфическое узнавание, или селекция связывания нуклеотидных последовательностей ДНК-белком, основано на физико-химических взаимодействиях между ними. ДНК-белковое узнавание осуществляется на нескольких уровнях, характеризуемых различными взаимодействиями и шкалой расстояний : от
электростатического взаимодействия на больших и средних расстояниях до узнавания белками вторичной и первичной структур ДНК. Этот многоуровневый механизм молекулярного узнавания обеспечивает высокую степень надежности, точности и воспроизводимости процесса генной экспрессии.
Первичные структуры ДНК часто интерпретируются как генетические тексты, написанные на неизвестном языке. Исследование генной экспрессии теоретическими и компьютерньми методами имеет поэтому два аспекта: формальный, или
информационный, и физико-химический. Формальный аспект проблемы включает в себя анализ символьных нуклеотидных последовательностей ( текст, записанный в четырехбуквенном алфавите ). Физико-химический же состоит в изучении структур ДНК, регуляторных белков, ферментов, их конформаций, физико-химических взаимодействий между ними. Эти два аспекта проблемы - текстологический и физикохимический , тесно взаимосвязаны. Существует тонкое и деликатное соответствие между организацией первичных структур и взаимодействиями, имеющими место при генной экспрессии.
Совершенно ясно, что организация экспрессии генов, и в частности процесса транскрипции, - одна из центральных проблем молекулярной биологии. Исследование ДНК-белковых взаимодействий, анализ и интерпретация генетических текстов, выработка самосогласованного описания биологических процессов узнавания на молекулярном уровне является несомненно актуальным как с научной, так и с прикладной точек зрения.
Цель и задачи исследования
Молекулярное узнавание промоторов РНК-полимеразой и регуляторньми белками осуществляется на нескольких уровнях: на уровне первичной структуры, вторичной, и структур более высокого порядка. Каким образом белки узнают специфические, функционально значимые нуклеотидные последовательности ДНК и от каких формальных ( на уровне первичной структуры ДНК ), структурных и физико-

химических свойств и характеристик зависит процесс молекулярного узнавания - это основные вопросы, которые возникают в проблеме ДНК-белкового узнавания.
Цель данной работы: изучение первичных структур и физических факторов, обусловливающих процесс белок-нуклеинового узнавания.
Для достижения этой цели предлагается подход, комбинирующий текстологический (информационный) и физико-химический аспекты ДНК-белкового узнавания. При этом будем придерживаться требования проводить расчеты конформаций и физико-химических характеристик на атомном уровне и на всех пространственных шкалах - от взаимодействий на коротких расстояниях до электростатических взаимодействий на средних и больших расстояниях. Это поможет рассмотреть процесс молекулярного узнавания на всех уровнях с достаточной точностью.
Рассмотрим задачи, возникающие в связи с обсуждаемой проблематикой.
1 .В настоящее время во взглядах на первичную структуру ДНК генома исходят из того, что геном представляет собой эволюционную, нелинейную динамическую систему, в символьной последовательности которой содержатся сведения о структуре и состоянии этой системы. Коль скоро принято это положение, дальнейшее исследование состоит в анализе и изучении организации и логики этой символьной последовательности. Это положение, подкрепленное многочисленными наблюдениями и опытными данными и принятое ныне в качестве парадигмы, сразу же позволяет применить к анализу нуклеотидных последовательностей методы теории динамических систем, теории информации, комбинаторики, теории хаоса, методы анализа сигналов и временных рядов.
В первом разделе данной работе в связи с изучением организации первичных структур ДНК мы решаем следующие задачи ( в большей части это будет относиться к промоторам, терминаторам и кодирующим последовательностям ДНК генома E.coli):
дадим доказательство того, что нуклеотидные последовательности ДНК геномов имеют фрактальные свойства. Основу доказательства составит метод вейвлет-преобразования;
вычислим Фурье- и вейвлет-спектры первичных структур промоторов , терминаторов, кодирующих участков ДНК генома E.coli;
методами статистической физики вычислим, а затем изучим статистические свойства промоторов, терминаторов, кодирующих участков ДНК E. coli;
решим задачу восстановления первичной структуры ДНК по ее перекрывающимся фрагментам.
2.В проблеме ДНК-белкового узнавания задача о зависимости структурных параметров двойной спирали ДНК от специфической последовательности нуклеотидов занимает важное место, т.к. структурные особенности двойной спирали узнаются белками и лигандами. Принцип комплементарного спаривания является ключевым в понимании структурной и функциональной организации нуклеиновых кислот. Исходно он базируется на предположении о плоском строении канонических азотистых оснований.
Задачи второго раздела работы следующие:
дадим доказательство того, что канонические азотистые основания , имеющие аминогруппы, неплоские;
установим, что внутренняя геометрия пары азотистых оснований (пропеллер и другие углы) и геометрия пар азотистых оснований в двойной спирали ДНК определяется фактором неплоскости азотистых оснований, имеющих аминогруппу.

В большинстве экспериментальных подходов точки контактов определяют с помощью модификации комплексов фермент-промотор специфическими для определенных оснований реагентами. По изменению чувствительности оснований к воздействию реагента в присутствии фермента и без него можно описать зоны контактов для комплексов РНК-полимеразы с промотором.
В работах [34, 35, 36] для этих целей использовался диметилсульфат, который метилирует гуанин в большой бороздке и аденин в малой бороздке. В нашем анализе мы опирались на результаты идентификации нуклеотидов промотора lacUV5 в контактах с отдельными субъединицами РНК-полимеразы E.coli [35, 35]. Обнаруженные в этой работе контакты интерпретируются авторами как солевые мостики, возникающие между положительно заряженными остатками лизина субъединиц РНК-полимеразы и отрицательно заряженными фосфатньми группами ДНК.
Методом Фурье-анализа [27] обнаружена периодичность в расположении точек контактов полной РНК-полимеразы E.coli на нескольких промоторах (lac UV5, Т7 A3, tetR, X cin, X cl7, trpS.t. и RNAI).
Нами обнаружена периодичность в контактах между РНК-полимеразой и промоторами (рис. 1.10-1.13). Для lacUV5-промотора обнаружены периодичности в контактах с полной РНК-полимеразой, соответствующие 2, 7 и 11.5 нуклеотидам (для цепи 5’-3’) и 3.5, 8, 10 и 12.5 нуклеотидам (для цепи 3’-5’). Характер периодичностей в расположении точек контактов РНК-полимеразы и промотора свидетельствует о том, что эти точки находятся не на одной и той же стороне поверхности ДНК (если считать, что ДНК находится в классической В-форме).
Рис.1.10. Периодичности пуринов для 5’-3’ цепи lacUV5 промотора E.coli ( пунктирная линия) и периодичности точек контакта между полной РНК-полимеразой и 5’-3’ lac UV5 промотором
(сплошная линия)