Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте

• Автор: Хохлов, Александр Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 70 с. : ил.

Разработать мул ьти вол новой осветитель па свсрхярких излучающих полупроводниковых диодах для идентификации и исследования одиночных хемосенсорных клеток методом флуоресцентной микроскопии. Разработать двухканальный олфактометр для поддержания и регистрации электрической активности изолированного обонятельного эпителия и стимуляции его газовыми пахучими стимулами заданной концентрации. Исследовать роль субпопуляции гастдуцинположительных рассеянных хемосснсорных клеток в генерации ответов на 2гептанон синтетический феромон мышей. Для интерпретации полученных данных разработать математическую модель суммарного элеюричсского ответа обонятельного эпителия, генерируемого при участии нескольких популяций хсмосенсориых клеток. Был разработан и построен двухканальный олфактометр, который позволяет поддерживать и регистрировать электрическую активность изолированного обонятельного эпителия до 5 часов и стимулировать его пахучими стимулами в виде калиброванной смеси воздуха и насыщенных паров пахучих веществ. Идея создания данного прибора возникла при анализе современных тенденций в электрофизиологии. Дело в том, что классическая микроэлектродная техника, а затем и метод i, революционизировавший клеточные исследования и позволивший решить многие задачи от регистрации активности одиночных ионных каналов до анализа экспрессии генов в одиночных клетках, вытеснили на какоето время некогда традиционные электрофизиологические методы исследования. В частности, исследователи практически отказались от измерения трансэпителиальных токов и потенциалов, которые, естественно, уступают по своей информативности современным методам клеточной биологии. Тем не менее, в последние годы возродился интерес к относительно простым электрофизиологичсским методикам, таким как экстраклеточное отведение или методика Усиша для измерения электрической активности эпителиев i , , которые позволяют осуществлять экспрессанализ функционального состояния биологических объектов с разными уровнями организации. Связано это с рядом обстоятельств, из которых в контексте данной работы следует отметить следующее. Простые электрофизиологические методы часто дают возможность выявить функциональные последствия подобных манипуляций. В качестве примера отметим, что мыши с нокаутированным геном аденилилциклазы типа 3, которая в норме специфически экспрессируется в обонятельных нейронах, становились полными аносмиками по отношению к простым запахам, что успешно выявлялось по олфактограмме . Была проведена разработка мультиволнового осветителя на свсрхярких излучающих диодах для исследования одиночных хемосснсорных клеток методами флуоресцентной микроскопии, в том числе, с использованием флуоресцентных зондов. Основанием для постановки такой задачи явилось следующее. Если исключить дорогостоящую конфокальную микроскопию, традиционным для флуоресцентных приложений является использование осветителей на основе ксеноновых ламп достаточно нестабильный источник света в сочетании с оптическими фильтрами или монохроматорами. В первом случае имеется плохо перестраиваемая система с ограниченным набором длин волн две, как правило. Во втором, платой за широкий спектральный диапазон является потеря светосилы иили чувствительности. Например, в светосильных монохроматорах на дифракционных решетках, которые обеспечивают возбуждение на произвольных длинах волн, фоновая засветка составляет порядка 0. Наличие достаточно интенсивного паразитного света является одним из основных факторов, ограничивающих чувствительность регистрации и недостаточное соотношение сигналшум. Между тем, нами планировались идентификация клеток с помощью флуоресцентных маркерных белков, исследование одиночных клеток с помощью флуоресцегггных зондов и использование нескольких красителей одновременно. Для этого были необходимы мул ьтивол новое монохром атичнос возбуждение и идеальное спскгральное разделение возбуждения и эмиссии. Достоинством излучающих диодов является то, что они работают в узком спектральном диапазоне относительно длины волны максимального излучения тагЫО нм, уже выпускаются диоды с Д.