Фототаксис в Halobacterium salinarum : Картирование региона взаимодействия сенсорного родопсина 1 и трансдьюсера 1 и функциональная характеризация сенсорного родопсина 2

• Автор: Миронова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

РЬоюигх ш Н.БаГташт

Список сокращений в тексте

Введение

Глава. Литературный обзор

1.1 Введение ретииальсодержащие белки архебактерий

1.2 Структу ры сенсорного родопсина 1 и сенсорного родопсина 2

1.3 Фотоциклы сенсорных родопсинов

1.4. Структура трансдьюсеров сенсорных родопсинов

1.5 Структура и функции комплексов сенсорных родопсинов и их

галобактериальных трансдьюсеров

1.6 Представление о молекулярных механизмах передачи сигнала
1.7 Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Оборудование и материалы
2.1.1. Оборудование
2.1.2. Материалы и химические реагенты
2.1.3. Буферы и растворы
2.2. Клонирование и работа с Е.соИ
2.2.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
2.2.2. Методы клонирования и работы с Е.соИ
2.3. Очистка и приготовление образцов белка
2.3.1. Выделение и очистка белков
2.3.2. Анализ качества рекомбинантных белков
2.3.3. Реконструкция сенсорных родопсинов 1 и 2 и совместная
реконструкция сенсорного родопсина 1 и его трансдьюсера в липидные мембраны
2.4. Спектроскопические методы
2.4.1. Измерение спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой области
3 xi i . i
2.4.2 Измерение времени жизни переходного состояния СМ3
2.4.3 Лазерный импульсный фотолизис
2.4.4. Рамановская спектроскопия
Глава 3. Картирование региона взаимодействий между сенсорным
родопсином 1 и его галобактериальным трансдыоссром
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка и реконструкция
архебактериальных белков
3.1.1. Основы клонирования, экспрессии и очистки сенсорного
родопсинов из . и их трансдьюсеров
3.1.2. Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 1
3.1.3. Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 1
3.1.4. Клонирование, экспрессия и очистка галобактериального
эрансдыосера 1
3.1.5. Клонирование, экспрессия и очистка дслеционных мутантов
галобактериального траисдыосера 1
3.2. Реконструкция сенсорных родопсинов и их комплексов с
галобактсриальными трансдьюсерами в полярные липиды
3.3. Кинетика возращения основного состояния сенсорного
родопсина 1 в полярных липидах пурпурных мембран
.
3.4. Исследование взаимодействия сенсорного родопсина 1 с
укороченными трансдьюсерами, полученными из очищенных компонентов, после совместной реконструкции в полярные липиды пурпурных мембран
3.5. Получение химерных белков, состоящих из сенсорного
родопсина 1 и его укороченных трансдьюсеров, и иследопанис кинетики возращения основного состояния СР1 в мембранах .i.
4 РИоилахз п Н.5а1пагшп
3.5.1. Клонирование и экспрессия химерных белков сенсорного
родопсина 1 и делеционных мутантов галобактериального траисдыосера 1
3.5.2. Кинетика возращения основного состояния гибридных белков,
состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьюсеров, в мембранах Е. со И
3.6. Возможное объяснение механизма независимости
времени распада Мсостояния комплексов сенсорного родопсина 1 от
3.7. Основные результаты
Глава 4. Функциональная характеризация сенсорного родопсина 2 из
НаоЬасегшт БаГтагит, экспрессированного в Е.со
4.1. Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 2
4.2. Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 2
4.2.1. Анализ качества белка методами ДСН гсльэлсктрофорсза и
иммуноблотинга
4.2.2. ЕБ массспектрометрия
4.3. Биофизический анализ фотохимический анализ
4.3.1. иУУБ спектроскопия
4.3.2. Рамановская спектроскопия
4.3.3. Лазерный импульсный фотолизис
4.4. Основные результаты
Выводы
Список использованной литературы


Гтр2 имеет интересную особенность, отличающую его от других трансдыосеров нсриплазматический домен, позволяющий ему функционировать как хеморецептору. Трансдыосеры сенсорных родопсинов архебактерий высоко гомологичны хеморецепторам эубактсрии, представляя, тем самым, особый интерес для исследователей как эволюционио родственные белки. Исследования этих рецепторов самих по себе или в комплексе с соответствующими трасдыоссрами позволит больше узнать о связи структуры и функции гомологичных белков, углубить понимание механизмов фото и хемотаксиса, а также эволюции механизмов передачи сигнала в клетках вообще и эволюции рецепторов в частности. Цели и задачи. СР2 один из наименее исследованных ретинальных белков архебактерий. Хотя он был обнаружен в году, наши познания ограничены лишь некоторыми особенностями его фотофпзиологии на основании спектроскопических данных. Причиной тому является его нестабильность и, следовательно, невозможность получить необходимые для исследований количества белка. Решению этой проблемы и посвящена первая часть данной работы. Цслыо второй части работы было изучение природы взаимодействия между СР1 и его белкомпартиером Гтр1. Первоначальной задачей было нахождение оптимальных условий экспрессии и очистки рецептора и трансдыосера. Затем требовалось разработать метод совместной реконелрукции СР1 самого но себе и с трансдыосером. Наконец, было необходимо прокартировать регион взаимодействия между этими белками и найти минимальный по длине цитоплазматической части, но все еще взаимодействующий с СР1 трансдыосср. Научная новизна. Достигнута функциональная экспрессия СР2 из i iii в клетках ii i, разработана эффективная методика его очистки и реконструкции в липидные мембраны. Это дало возможность исследовать фотохимические свойства фобородопсина в разном окружении. Впервые получен рамаповский спектр СР2 в липидном окружении, дающий ценную информацию об особенностях структуры его хромофора. Хотя методы экспрессии и очистки I были опубликованы ранее, они не удовлетворяли требованиям к качеству белка и были существенно модифицированы, что повысило чистоту рекомбинантного СР1. То же относится к полноразмерному Гтр1 и его делеционным мутантам вместо экспрессии в . Впервые проведена успешная реконструкция СР1 в мембраны полярных липидов пурпурных мсбраи . Проанализировано влияние делеционных мутантов трансдьюсера на фотоцикл сенсорного родопсина 1. Кроме того, созданы химерные белки, состоящие из СР1 и Гтр1 длиной , и 7 аминокислотных остатков, а также химерный белок, состоящий из СР1 и цитоплазматического участка Гтр1 между и 7 аминокислотными остатками. Проверена функциональность данных конструкций. Установлены важные различия в фотохимическом поведении СР1 и Гтр1 после совместной реконструкции в мембраны полярных липидов пурпурных мебран . СР1Гтр1 в нативных мембранах . Глава 1. Введение ретинальсодержащие белки архебактерий. Фотосинтез основа существования всего живого на Земле автотрофные организмы накапливают биомассу, потребляемую потом всеми остальными членами пищевой пирамиды, и выделяют в качестве побочного продукта кислород, без которого невозможно дыхание. Довольно длительное время считалось, что без участия хлорофилла фотосинтез неосуществим. Однако в начале х гг. Д. Остсрхельтом и В. Стокениусом . Архебактерий хотя и являются прокариотами, так значительно отличаются от эубактерий и эукариот, что выделяются учеными в отдельное царство 3. Рис. Электронная микрофотография i i 4. Основной способ получения энергии экстремальными галофилами аэробное дыхание. В цитоплазматической мембране обнаружены цитохромы Ь, с, а также цитохромоксидаза отипа. Электроны в дыхательную цепь поступают с НАДзависимых дегидрогеназ. В анаэробных условиях в темноте источником энергии может служить анаэробное дыхание с использованием ЫОз в качестве конечного акцептора электронов, а также процесс сбраживания аргинина и цитрулина. Свет служит дополнительным источником энергии, аппарат для использования которого подключается при недостатке в среде питательных веществ и кислорода.