Шунтирование переноса электронов с митохондриальной НАДН-дегидрогеназы на природные и искусственные акцепторы

• Автор: Шарова, Ирина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 141 с. : ил.

1. Электронтранспортнаи цепь

1.1 Окислительное фосфорилирование.

1.2 Роль митохондрий и их структура.

2. Структура 1МАВНСо2редуктазы

2.1 Место Комплекса I в дыхательной цепи, перенос электронов

и протонов

2.2 Состав и структура прокариотических и эукариотических дегидрогеназ.

2.3 Характеристика ГеБ кластеров Комплекса

2.4 Филогения Комплекса 1.

2.5 Биогенез Комплекса

3. Каталитическая активность дегидрогеназы

3.1 Каталитические свойства КАОНСоСредуктазы.
3.2 Ингибиторы ЫАЭНСоОредуктазы.
3.3 Механизмы переноса электронов и протонов
3.4 Роль железосерных кластеров и БМЫ в механизме катализа Комплекса
4. Нарушения Комплекса I и связанные с ними болезни
4.1. Энцефаломиопатии.
4.2. Заболевания, связанные с изменениями в митохондриальном
геноме генетические изменения
4.3 Митохондрии и гипоксия
II Материалы и методы
1. Выделение митохондрий из сердца быка.
2. Получение митохондриальных частиц
3. Измерение ферментативной активности
4. Фотохимические опыты.
5. Флуориметрический анализ.
6. Эксклюзионная хроматография
7. Полярография.
8. Электрофоретические методы.
9. Определение концентрации белков,.
III Результаты н их обсуждение
1. Сравнительное изучение дгидгнзнй и ВНферрнцианидредуктазной активности митохондрий.
1.1. Окисление ЫАЭН в суспензии митохондрий.
1.2. Действие ионного детергента на препараты митохондрий
1.3. Получение оптически прозрачных митохондриальных фракций.
2. Роль флавина, убихинона и желсзосерных кластеров в переносе электронов на искусственные и природные акцепторы.
2.1. Роль флавина в передаче электронов в Комплексе 1.
2.1.1. Деструкция флавинов при облучении синим светом
2.1.2. Влияние деструкции флавина на скорость окисления митохондриями
2.1.3. Динамика спонтанного изменения флавиновой флуоресценции митохондриальной суспензии
2.2. Роль железосерных кластеров в переносе электронов
2.3. Лагпериод в митохондриальных ре доке реакциях
ЫАОН ДХФИФ.
2.4. Роль коэнзима Р в шунтировании реакций окисления ЫАОН
в митохондриях
2.5. Влияние цитохрома с на ЫАОНоксидазную реакцию,
IV Заключение.
V Выводы
VI Список литературы
Список сокращений
аденозиндифосфат
АМР аденозинмонофосфат
АТР аденозинтрифосфат
ДХФИФ 2,6 дихлорфенолиндофенол
пНТФ паранитротетразолиевый фиолетовый
никотинамиддинуклеотид восстановленный
железосерные кластеры
флавинмононуклеотид
флавинадениндинуклеотид
i, убихинон, кофермент
Р поляризация флуоресценции т время жизни флуоресценции.
Введение


Протонный потенциал, в свою очередь, может реализоваться в синтезе АТР. Система до уровня цитохром с обратима. Конечная стадия перенос электрона от цитохром а3 на кислород не обратима. Изолированные Комплексы , III и IV каждый катализируют сопряженную с переносом электрона транслокацию протона через мембрану, происходящую в фосфолипидных везикулах Вагасса е Ы. ОЬеП е а1. Также показано, что одновременное включение Комплексов I или IV с АТРсинтазой в липосомы способно реконструировать окислительное фосфорилирование Нае, . Митохондрии являются клеточными органеллами, выполняющими функцию синтеза АТР, то есть образования энергии для обеспечения практически всех функций организма. Наличие собственной ДНК и системы белкового синтеза, а также наличие двойной мембранной организации, делает гипотезу симбиотического происхождения митохондрий общепринятой ivi. Таблица 1. Характеристика Комплексов дыхательной цепи. Комплекс 6 мономер Колво Полипептидов, субь единиц Кодируют ся митох. ДНК Простетич. Ь2. В последнее время показано, что процессы транспорта ионов и поддержания ионного гомеостаза в клетке также являются одной из существенных функций митохондрий. Митохондрии являются основными силовыми станциями живых тканей. Естественно, нарушения в митохондриях приводят к существенным сдвигам в процессах энергообразования и транспорта ионов, что проявляется в тяжелых заболеваниях. В патологический процесс при этом вовлекаются в основном нейромышечные системы, требующие для своей работы большое количество энергии. Система окислительного фосфорилирования эукариот находится во внутренней мембране митохондрий, которая состоит из белка и липидов. Липиды в основном представлены фосфотидилхолином , фосфотидилэтаноламином и кардиолипином . В митохондриях сердца быка около белков внутренней мембраны являются белками, участвующими в системе окислительного фосфорилирования. ННеЕ, . При изучении митохондриальной ЫАОНдегидрогеназы традиционно используются препараты митохондрий, субмитохондриальных частиц СМЧ и изолированный Комплекс I. Однако каждый из этих препаратов имеет свои границы применения. Нами был предложен экспрессметод получения нативных малых митохондриальных частиц с помощью фильтрования суспензии через миллипоровые фильтры. Полученные таким способом митохондриальные частицы размером менее 0,2 мкм протомитохондрии имеют полную активную дыхательную цепь. В нашей лаборатории было показано Шишмаков и др. АЛР, состав белков, наличие ДНК, содержание цитохромов, ЫАЭН и флавинов. Преимуществами спектральной работы с данной фракцией является то, что она оптически прозрачна, почти не рассеивает свет при этом дыхательная цепь сохраняет свою нативную структуру. Не смотря на то, что в последнее десятилетие были опубликованы обзоры, аккумулирующие значительные успехи в исследованиях Комплекса I ii, , , новые исследования ставят, зачастую, больше вопросов, чем дают ответов. По этой причине необходим современный анализ новых данных по Комплексу I, важный как для исследователей в области фундаментальной науки, так и для врачей, работающих в клинической области. Комплекс I является названием для убихинон оксидоредуктазы митохондриальной дыхательной цепи млекопитающих. В более широком смысле он используется как обобщающее название для семейства хинон оксидоредуктаз, которое включает ферменты бактерий и даже переносящие ферменты, обнаруженные в некоторых организмах. ЫАОНКоСоксидоредуктаза Е. С. 1. Фермент катализирует ротенонзависимое восстановление убихинона или его аналогов, а также сопряженный с транспортом электронов направленный перенос протонов через мембрану. В году Комплекс I был выделен первый раз из митохондрий сердца быка i . В течение последующих лет в этой области был достигнут значительный прогресс, и на сегодняшний день накоплен большой объем информации о структуре и механизмах взаимодействия комплексов окислительного фосфорилирования. В отличие от Комплекса I, знания о структурах и функциях других комплексов значительно расширились после получения их в кристалличесом виде.