Фосфорилирование низкомолекулярного полипептида в митохондриях, его идентификация и участие в регуляции функций митохондрий

• Автор: Одинокова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Фосфорилирование митохондриальных белков и регуляция функций митохондрий.

1.1.1. Обнаружение фосфорилированных белков в митохондриях.

Попытки идентификации фосфобелков. Локализация протеинкиназ и протеинфосфатаз в митохондриях.
1.1.2. Регуляция НАДНдегидрогеназ цикла Кребса системой вторичных мессенджеров. Роль Са2 и фосфорилирования, зависимого от протеинкиназ и протеинфосфатаз.
1.2. Са2транспортируюшая система и участие Са2 в регуляции митохондриальных функций.

1.2.1. Со2транспортирующая система митохондрий.

1.2.2. Неселективная Са2, Су б А чувствительная пора во внутренней мембране митохондрий.

1.3. Структура и функционирование Е0ЕгАТРазы

митохондрий.

1.3.1. Хемиосмотический синтез АТФ. Сопряжение транспорта и синтеза АТР. Регуляция окислительного фосфорилирования с помощью дыхательного контроля.
1.3.2. Субъединичная структура Г Лг А ТРазы, локализация субъединиц в Ло и Р секторах.
1.3.3. Современные представления о механизме работы Л Лг
А ТРазы. Вращение субъединиц в Г0 и Л секторах. Роль субъединиц а, Ь и с в транспорте ионов И.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Спектр фосфобелков и относительные уровни
включения Р.
3.2. Влияние ЭГТА, Са2 и СССР на фосфорилированис 3.5 кДа пептида.
3.3. Очистка и идентификация 3.5 кДа фосфопептида.
3.3.1. Определение локализации фосфопептида в митохондриях.
3.3.2. Выделение и очистка 3.5 кДа фосфопептида.
3.3.3. Идентификация 3.5 кДа пептида как полипептида, иммунореакт йен ого к антителам к субъединице с АТРазы.
3.4. Фосфорилирование ИРАСП и активность 0i3i.
3.4.1. Влияние ионов Са2 па окислительное фосфорилирование и активность г АТРазы.
3.4.2. Влияние физиологических концентраций Са2 на фосфорилированиедефосфорилирование ИРАСП.
3.5. Фосфорилирование ИРАСП и открытие шРТР.
3.5.1. Дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР и падении мембранного потенциала.
3.5.2. Влияние ИРАСП на процесс открытия неселективной митохондриальной поры.
3.5.3. Влияние ИРАСП на проводимость БЛМ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Фосфорилирование ИРАСП и активность 0i3i. Влияние ионов Са2 па окислительное фосфорилирование и активность г АТРазы. Влияние физиологических концентраций Са2 на фосфорилированиедефосфорилирование ИРАСП. Фосфорилирование ИРАСП и открытие шРТР. Дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР и падении мембранного потенциала. Влияние ИРАСП на процесс открытия неселективной митохондриальной поры. Влияние ИРАСП на проводимость БЛМ. Обратимое фосфорилирование белков является одной из основных посттрансляционных модификаций, ответственных за регуляцию различных видов клеточной активности системой вторичных мессенджеров. Как правило, Са2 или сАМР как вторичные мессенджеры изменяют активность протеинкиназ ПК или протеинфосфатаз ПФ, которые в свою очередь поддерживают фосфорилирование ферментовмишеней на определенном уровне. Согласно данным , каждый третий белок в эукариотических клетках подвержен обратимому фосфорилированию , . Фосфорилирование белкамишени ведет к конформационной перестройке молекулы и соответствующим изменениям ферментативной активности или взаимодействия с другими клеточными компонентами. Данные о фосфорилировании митохондриальных белков и о регуляции функций митохондрий системой вторичных мессенджеров крайне ограничены. За последние лет обнаружено и детально изучено фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са2 как вторичными мессенджерами посредством ПКзависимого фосфорилирования , , , i , . Однако до последнего времени отсутствовали какиелибо определенные данные и представления о возможности ПК и ПФ зависимой регуляции таких ключевых процессов митохондрий, как синтез АТФ, перенос электронов по дыхательной цепи и транспорт ионов непосредственно через внутреннюю митохондриальную мембрану. Фосфобелок с молекулярной массой кДа из митохондрий бычьего сердца идентифицирован как субъединица комплекса I, а фосфобелок кДа как субъединица цитохромсоксидазы показана также ассоциация кДа фосфобелка с комплексами I, III, IV и V митохондрий i . . , . В целом можно констатировать, что вопрос о возможности регуляции трансформации энергии во внутренней митохондриальной мембране системой вторичных мессенджеров в настоящее время остается открытым. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфорилйрования митохондриальных белков с целью возможного выявления новых фосфопептидов, выяснения их локализации в митохондриях и участия в процессах синтеза АТФ и транспорта ионов кальция. Эти исследования позволят выяснить, подвержены ли системы преобразования энергии во внутренней митохондриальной мембране ПКзависимой регуляции системой вторичных мессенджеров. Целью данной работы являлось выявление новых мембраносвязанных фосфопептидов в митохондриях, исследование факторов, регулирующих их фосфорилирование, и выяснение возможности регуляции функций митохондрий путем фосфорилированиядефосфорилирования этих пептидов. Обнаружение новых фосфорилированных полипептидов одного или нескольких в митохондриальной мембране и выявление оптимальных условий для их фосфорилирования. Идентификация вновь обнаруженного фосфорилированного полипептида и выявление его принадлежности к функциональным системам митохондрий. Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования дефосфорилирования полипептида ионами Са2 как вторичными мессенджерами. Изучение корреляции уровня фосфорилирования найденного полипептида с функциональными параметрами митохондрий скоростью окислительного фосфорилирования, транспортом Са2, мембранным потенциалом и проницаемостью митохондриальных мембран. Научная новизна. Впервые во внутренней мембране митохондрий обнаружен низкомолекулярный фосфопептид, молекулярная масса которого была определена равной 3. Да согласно его электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле.