Исследование чувствительности трехферментных систем с бактериальной люциферазой при биотестировании водных экосистем

• Автор: Есимбекова, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Основы биологического тестирования Литературный обзор

1.1. Биологические методы тестирования окружающей среды

1.1.1. Задачи биологического тестирования

1.1.2. Тсстобьскты биологического тестирования .

1.1.3. Проблемы биотестирования. Необходимость создания системы биотестов .

1.1.4. Ферментативные биотссты т яйи.

1.2. Био.чюмннссцснтныс методы тестирования, основанные на светящихся бактериях.

1.3. Биотесгы. основанные на фсрмсигсубстрзтных комплексах светящихся бактерий .

1.3.1. Основные принципы и тестобъскгы для биолюминссцентного ферментативного биотесгироваиия .
1.3.2. Метод токсикантсмссь цугц.
1.3.3. Интегральный метод разработки бнолюминесцентных биотестов
1.3.4. Обоснование задачи .
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы, материалы и приборы .
2.2. Измерение парамегров биолюминесценгиых бнотестов
2.2.1. Биолюминесцентиый бнотсст с использованием светящихся
бактерий .
2.2.2. Бнолюминссцснтный биотест, основанный на двух ферментной системе НАДНФМНоксидоредуктазалюцнфераза .
2.2.3. Бнолюминссцснтный биотсст, основанный на трехферментной системе НАДЬЕФМНоксидорсдукгазалюцнферазаалкогольдсгидрогсназа
2.2.4. Биолюминесцентиый биотсст. основанный на трехферменгной системе НАДН.ФМНоксидорсдуктазалюциферазагринсин
2.3. Обьскгы исследования
2.3.1. Лесной пруд.
2.3.2. Лабораторные микроэкоснстемы .
2.3.3. Культуральная среда ЗрггиНпа р1иеп5
2.3.4. Экстракты зерна.
2.3.5. Сыворотка крови терапевтических больных .
2.4. Статистическая обработка результатов .
Глава 3. Исследование условий, влияющих на чувствительность
ферментативных биотесюв .
3.1. Методы конструирования трехферментных биолюминесцентных биотсстов.
3.2. Зависимость от физикохимических характеристик и строения антропогенною иоллютанта
3.3. Влияние длины цепи сопряжения ферментативных реакций
3.4. Зависимость от типа взаимодействий ферментов полиферментной реакции
3.4.1. Протсолитичсскис взаимодействия
3.4.2. Конкурентные отношения.
3.5. Зависимость от соотношения компонентов реакционной смеси.
3.6. Зависимость от условий приготовления анализируемых смесей и контрольных образцов
3.7. Влияние характеристик препаратов ферментов
3.8. Разработка трехферментных биолюминесцентных биотестов.
3.9. Выводы по главе 3.
Глава 4. Биолюминссцснтные биотссты в исследовании природных и
лабораторных экосистем.
4.1. Изучение влияния сезонных характеристик воды природного водоема
на реакцию биолюминесцентных биотсстов
4.2. Изучение реакции биотсстов на загрязнение водоема ксенобиотиками
4.3. Изучение реакции биотесюв на цветение водоема синезелеными водорослями.
4.4. Выводы по главе 4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .
ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА


С другой стороны, использование биолюминссцснтных методов позволяет предположить возможность создания системы ферментативных тестов в рамках биолюминесцентного анализа. Действительно, с помощью биолюминссцснтных методов можно измерять активность болсс ферментов. Биолюминссцсктный анализ характеризуется простотой, зкспрессностью. Кроме того, использование биолюминесцентного метода определения активности ферментов позволяет значительно уменьшить вариабельность результатов за счет перехода от живого объекта к реактиву. Искомая система экспрессных чувствительных ферментативных бнотесгов может быть создана путем использования цепей сопряжения ферментов с бактериальной люциферазой. Составлять основу системы должны наиболее простые и удобные в работе ферментативные реакции. Поэтому, при создании системы биотсстов, в первую очередь необходимо разработать биотесты на базе трехферментных реакций используя разные тины взаимодействий ферментов с бактериальной люцнферазой и выяснить факторы, влняюшие на их чувствительность. Из предварительных экспериментов мы можем предположить, что чувствительность ферментативных методов можно изменить путем варьирования соотношений компонентов реакционной смеси и их концентраций, использования растворимых или иммобилизованных препаратов ферментов, разных методов приготовления анализируемых и контрольных образцов и т. Знание способов варьирования чувствительности ферментативных биотестов позволит регулировать, настраивать систему биотсстов для решения конкретных задач экологического мониторинга. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Цель работы состоит в изучении чувствительности трехферментных реакций с бактериальной люцнферазой для создания системы биотестнровзння водных экосистем. Изучение способов регулирования чувствительности трсхфсрмсктных биолюминссцснтных биотсстов. Разработка ферментативных биотсстов на основе трехферментных бнолюмннесценгных реакций с разными типами взаимодействия ферментов на примере методов измерения активности алкогольдегидрогеназы и трипсина. Создание простейшей системы для биотестирования природных н лабораторных водных экосистем. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучены факторы регулирования чувствительностью бнолюмннесценгных ферментативных биотсстов, установлена их градация по степени важности в зависимости от целей и условий бнотестирования. Покачано, что основными механизмами влияния редоксактивных антропогенных поллютантов на изученные трехферментные биолюминесцентные системы являются окислительновосстановительные НАДНзависнмыс процессы. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Разработаны ферментативные биотесты на основе трехферментных реакций НАДНФМНоксидорсдуктазалюцифсразаалкогольдегнлрогсназа и НАДНФМИоксидоредуктазалюцнферазатрипсш. Предложены методы установления чувствительности биотестов необходимой для мониторинга. Впервые для бномоииторккга водных экосистем создана система из четырех биолюмннссцсптных биотестов, отражающая изменения качества воды, связанные с загрязнением антропогенными поллютантами и метаболитами синезеленых микроводорослей на фойе естественных сезонных колебаний характеристик воды в природных водоемах. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Конструирование трехферментных биотестов на основе сопряженной биолюминесцентной системы НАДН. ФМНоксилорсдуктазалюцифераза. Факторы регуляции чувствительности бнолюминесцентных полиферментных бнотестов. Система четырех биолюмннесцагтных биотсстов . АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. СанкгПетербур Берлин. Ланд, Швеция, 9ом и ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюмннесценини Вудс Хол, США, , Болония, Италия, XIII Биофизическом конгрессе Пью Дели, Индия. ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, препринт и тезисов и материалов конференций. СОДЕРЖАНИЕ И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 5 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы 3 источников, в том числе 7 зарубежных.