Биофизические аспекты микрохирургической реконструкции клетки. Разработка новых подходов и методов

• Автор: Никитин, Владимир Афанасьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 180 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. О РЕКОНСТРУКЦИИ КЛЕТКИ КАК ОДНОМ ИЗ ВАЖНЕЙШИХ ПОДХОДОВ В ВОПРОСАХ КЛЕТОЧНОЙ
ИНЖЕНЕРИИ

Исторический экскурс

Проблемы и методы реконструкции клетки млекопитающих

Микрохирургия клетки

Пересадка ядер

Механические способы энуклеации.

Энуклеация вслепую

Инъекция энуклеация.

Энуклеация с помощью выталкивания РЫ и прилегающей к нему
цитоплазмы через i.
Разделение ооцитов пополам
Неинвазивные методы энуклеации
Технология микрохирургии клетки.
Слияние кариопласта и энуклеированного ооцита.
Методы слияния
Микроинъекция
Методы прямой микооинъекиии.
Микроинъекция под давлением.
Разделение ранних предимплантационных эмбрионов близнецы
Приборы и оборудование
Микроманипуляторы.
Изготовление микроинструментов
Микроинъекторы
Заключение
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Биологический материал
Объекты исследования
Приготовление ранних эмбрионов мыши для, микрохирургии
Освобождение ранних эмбрионов от прозрачной оболочки.
Определение жизнеспособности микрохирургически разделенных
эмбрионов
Микрохирургия.
Сшиконизирование микропипеток
Микроинструмелты
Энуклеация.
Электросл ияние
Трансплантация зигот мышей в яйцеводы
Разделение эмбрионов кролика с использованием метода
наложения микролигатуры
Культивирование эмбрионов i vi после проведения
микрооперации
Трансплантация перевязанных пополам эмбрионов кролика
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЩИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ВСЕХ ВИДОВ МИКРОХИРУРГИИ
ЕДИНИЧНОЙ КЛЕТКИ.
Комплекс приборов для микрохирургии яйцеклеток ПМЯ1 Антивибрационный стол с основанием для прецизионных работ с
мнкрообъектами
Микроманипуляторы
Специализированны й микроман ипулятор
с вращающимся микроинструментом
Микроманипулятор снижающий поперечные колебания
микроинструмента
Мнкронньекторы.
Микроинъектор многодозовый .магнитострикиионный
Способы фиксации клетки.
Способ удерживания клетки микроприсоской
Мнкрокамсры
Микрокамера открытого типа.
Микрокамера для работы с клеткой под давлением.
Прибор для вытяжки стеклянных капилляров
Микроииструменты
Изготовление мнкроннструментов
Микрокузница МК2
Заточка микооинструментов
ГЛАВА 2. ПЕРЕСАДКА ЯДЕР
Реконструкция зигот лабораторных мышей при сочетании
микрохирургии и электростимулируемого слияния.
ГЛАВА 3. МИКРОИНЪЕКЦИЯ.
Изготовление и заполнение микропипеток
Микроинъектор многодозовыи
Микрокамера для многодозовых инъекций.
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИДЕНТИЧНЫХ
МОНОЗИГОТНЫХ БЛИЗНЕЦОВ
Разделение эмбрионов наложением микролигатуры.
Разделение ранних эмбрионов с помощью микроиглы. 9
Разрезание эмбрионов цилиндрическим участком микроиглы
Разрезание эмбрионов широким участком микроиглы
Разделение ранних эмбрионов скальпелем
Влияние содержания кальция в среде на микрохирургическое
разделение эмбрионов
Репродуктивное клонирование коров новый способ разделения эмбрионов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Эти результаты были с недоверием восприняты другими учеными, поскольку развитие взрослых особей из ядерных трансплантатов могло быть связано с использованием ядер первичных половых клеток, которые возникают из энтодермы и длительное время присутствуют среди клеток эпителия кишечника. В последующих работах Грдои брал в качестве донорских ядра дифференцированных клеток межпальцевых перепонок шпорцевой лягушки, и при пересадке ни одно из них не обеспечивало развитие дальше стадии нейрулы. Ди Берардино и Хоффнср в г. i i, , также показали, что ядра таких дифференцированных клеток амфибий ii, как эритроциты, при пересадке в энуклеированные ооциты могут поддерживать развитие только до стадии ранней гаструлы. Однако попытки получить взрослых особей были безуспешными, и Ди Берардино в г. i i, . Проблема клонирования амфибий остается нерешенной и но сей день Шкуматов, . Теперь уже можно судить о том, что эта модель для подобных исследований была выбрана не очень удачно, поскольку самые большие успехи были достигнуты при клонировании не амфибий, а млекопитающих. Однако опыты с пересадкой клеточных ядер в энуклеированные яйцеклетки амфибий дали возможность глубже заглянуть в тонкие механизмы функционирования клеточного ядра и доказать, что ядра различных дифференцированных клеток одного организма генетически идентичны i i, . Со времени экспериментов Бриггса и Кинга i, i, по пересадке ядер на лягушках, технология пересадки ядер широко использовалась для изучения взаимодействий ядра и цитоплазмы в процессе развития организмов на амфибиях. Успехи в реконструкции клетки методом пересадки ядер, достигнутые на зародышах амфибий, рыб и беспозвоночных, вселяли уверенность в принципиальную возможность клонирования организмов i i, . Однако применение этого метода на эмбрионах млекопитающих встретилось с огромными трудностями объем яйцеклетки млекопитающих более чем в раз меньше объема ооцита илацентарных , Васецкий, а. Были попытки осуществить пересадку ядер с помощью вирусиндуцируемого слияния ядер и оплодотворенных или неоплодогворенных яйцеклеток . ., i, , . Первое сообщение о развитии эмбрионов млекопитающего до стадии морулы после пересадки ядер было сделано Бромхол , , более чем через лет со времени начала успешных экспериментов на амфибиях. Автор использовал и микрохирургию, и слияние бластомеров для переноса меченых ядер морул кролика в его неоплодотвореиные яйцеклетки. В серии экспериментов с использованием микроинъекции бластомер вводили в яйцеклетку микропипеткой с внутренним диаметром 8 мкм. Слияние индуцировалось действием инактивированного вируса Сендай V, ii vi , который в то время широко использовался для получения клеточных гибридов. Было показано, что ядро продвинутой стадии эмбриона способно активировать делений неоплодотворенной яйцеклетки, в определенном смысле заменяя сперму как инициатора развития яйцеклетки на ранних стадиях, хотя и в небольшом числе случаев. Ядра донора идентифицировали по радиоактивной метке после инъекции бластомера эти ядра выявляли в 5,5 случаев, а после вирусиндуцируемого слияния в ,8 случаев. Автор не дает никаких объяснений этому, однако отмечает, что в ряде случаев 7,1 после микроинъекции оказалось, что произошла самопроизвольная энуклеация ядра яйцеклетки, а в 5,2 се хромосомы оказывались, диспергированными в цитоплазме, и приводит фотографии своего метода инъецирования в яйцеклетку. Можно отметить по этим фотографиям ряд моментов микрооперации, которые можно оценить как повреждающие для клеток или ядер. Вопервых, при удерживании яйцеклегки ее содержимое интенсивно отсасывалось, что видно по тому, что большая часть наружного, муцинового слоя яйцеклетки ушла в полость присоскидержателя для помещения бластомера в микроинъекционную микропипетку его сначала деформировали, засасывая в колбасообразную, по выражению автора, пипетку, и только после этого засасывали в мнкропипстку после проведения микроинъекции яйцеклетки удаляли, засасывая их так же, как и в предыдущих случаях, в пипетку с большим диаметром с помощью о грицательного давления.