Холиновый и фенольный биосенсоры для высокочувствительного определения ферментов-маркеров патологических состояний

• Автор: Громова, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ферментымаркеры патологических состояний.

1.1.1. Ацстилхолинэстераза.

1.1.2. Бутирилхолинэстераза

1.1.3. Карбокси лэстераза

1.1.4. Параоксоназа

1.1.5. 1Чацетилр0глюкозаминидаза.

1.2. Методы определения активностей ферментовмаркров.

1.2.1. Методы определения холинэстераз крови.

1.2.2. Методы определения активности КЭ
1.2.3. Методы определения активности ПОН
1.2.4. Методы определения субклинического мастита коров
1.2.5. Методы определения активности НАГ азы.
1.3. Методы определения ключевых аналитов
1.3.1. Холиноксидаза и методы определения холина.
1.3.2. Тирозииаза и методы определения фенола
1.4. Технология последовательного нанесения полиэлсктролитов ПНП
1.4.1. Факторы, влияющие на рост пленок
1.4.2. Режимы роста полимерных пленок
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы.
2.2. Методы
2.1.1. Создание планарных графитовых электродов
2.1.2. Формирование пероксидчувствительного слоя.
2.1.3. Формирование холиноксидазных биосенсоров
2.1.4. Окисление мультистенных углеродных нанотрубок МСУНТ и стержней УНС.
2.1.5. Титрование карбоксильных групп мультистенных углеродных нанотрубок.
2.1.6. Формирование тирозиназных биосенсоров.
2.1.7. Измерение электрохимических откликов
2.1.8. Приготовление гемолизата крови для анализа
2.1.9. Электрохимическое определение активности ацетилхолинэстеразы
2.1 Ингибирование активности АХЭ в крови мышей гуперзином А в экспериментах i vi.
2.1 Электрохимическое определение активности бутирилхолинэстеразы
2.1 Ингибирование активности БХЭ в крови мышей изоОМПА в экспериментах i vi.
2.1 Электрохимическое определение активностей карбоксилэстеразы
2.1 Ингибирование активности КЭ в крови мышей параоксоном в экспериментах i vi.
2.1 Спектрофотометрическое определение активностей эстераз в экспериментах по дозозависимому ингибированию i viv
2.1 Электрохимическое определение активности параоксоназы в крови
2.1 Ингибирование активности ПОН1 в крови мышей ЭДТА в экспериментах i vi.
2.1 Спектрофотометрическое определение активности ПОН1 в крови человека.
2.1 Электрохимическое определение активности НАГ азы.
2.1 Спектрофотометрическое определение активности НАГазы в молоке.
2.1 Получение АСМизображсний
2.1 Квазиупругое динамическое светорассеяние.
2.1 Получение СЭМизображсний
2.1 Турбидиметрическое титрование
2.1 Спектры поглощения наночастиц золота.
2.1 Обработка результатов
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
3.1. Холиновые биосенсоры
3.1.1. Характеристика типа исходной поверхности
3.1.2. Влияние анионного состава буферного раствора на процесс адсорбции поликатиона
3.1.3. Влияние катионного состава буферного раствора и ионной силы на процесс адсорбции поликатиона
3.1.4. Влияние природы одновалентного катиона и аниона на процесс адсорбции холиноксидазы
3.1.5. Использование углеродных наноматериалов для создания холинового биосснсора.
3.1.6. Холиновый биосенсор на основе планарных электродов.
3.1.7. Изучение влияния времени адсорбции и концентрации компонентов на активность планарного холинового биосенсора.
3.1.8. Влияние катионноанионного состава буферного раствора ноликатиона на активность холинового биосенсора.
3.1.9. Влияние этилового спирта на адсорбцию компонентов
3.1 Зависимость активности биосенсора от числа циклов нанесения слоев полимера и фермента.
3.1 Аналитические характеристики планарных холиновых биосспсоров и кинетические параметры холиноксидазы в пленках полимера.
3.2. Фенольный биосенсор на основе планарных электродов.
3.2.1. Изучение параметров, влияющих на активность фенольного биосенсора
3.2.2. Использование ианоматериалов для создания фенольного бносенсора
3.2.3. Аналитические характеристики планарных фенольных биосенсоров.
3.2.4. Стабильность планарных фенольных биосенсоров при хранении
3.3. Применение холинового и фенольного биосенсоров для анализа
ферментовмаркеров в крови.
3.3.1. Подбор оптимальных условий измерения продуктов ферментативного гидролиза.
3.3.2. Оценка влияния матрицы на аналитический сигнал при определении активностей ферментовмаркров
3.3.3. Верификация биосенсориых измерений стандартной спектрофотомстрической методикой
3.3.3.1. Селективное i vi ингибирование активностей ферментовмаркров в цельной крови гемолизате
3.3.3.2. Селективное i viv ингибирование активностей АХЭ, БХЭ и КЭ в цельной крови гемолизате
3.3.3.3. Определение активности параоксоназы в крови человека.
3.4. Применение фенольного биосеисора для определения активности
НАГ азы в молоке.
3.4.1. Подбор оптимальных условий измерения продукта ферментативного гидролиза.
3.4.2. Измерение активности АГазы в молоке коров
3.4.3. Верификация биосенсориых измерений.
4. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Низкая активность этого фермента была обнаружена у пациентов, страдающих тяжелыми заболеваниями печени, такими как острый гепатит и цирроз. В статье описывается строгая корреляция между активностью ЛХЭ в плазме и содержанием альбумина 0,, холестерина, протромбиновой активностью и т. В послеоперационный период активность АХЭ снижается на . Снижение активности АХЭ в крови может также указывать на отравление пестицидами ФОС и карбаматы, использующимися в сельском хозяйстве. Специфическое действие этих веществ на активность холинэстераз заключается в том, что они ковалентно связываются с серином активного центра фермента, тем самым необратимо ингибируя фермент. Ингибирование АХЭ приводит к переизбытку ацетилхолина в синапсе, в результате чего происходит его гипервозбуждение и нарушение нормального функционирования. Симптомами отравления может являться повышенное пото и слюноотделение, тошнота, отдышка, затруднение дыхания . При сильном отравлении происходит расстройство чувствительности, появление судорог, конвульсий, потеря сознания, что в конечном итоге может привести к параличу дыхательной системы, прекращению дыхания и смерти . Точность определения активности АХЭ в крови пациента и своевременная диагностика необходимы для предотвращения развития тяжелых последствий отравления. Контроль активности АХЭ является важнейшей процедурой при наблюдении пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Развитие этой болезни, являющейся основной причиной старческого слабоумия, связывают с низкой активностью фермента, ответственного за синтез ацетилхолина, ацетилхолинтрансферазы. Одним из методов лечения этой болезни является использование препаратов, способных ингибировать АХЭ такрин, ривастигмин и др. Постоянный мониторинг активности АХЭ необходим для людей, у которых диагностирована фснилкстонурия. В работе было показано, что концентрация фенилаланина и активность АХЭ в крови находятся в обратной зависимости. Авторы предполагают, что это может быть объяснено либо непосредственным ингибированием АХЭ фенилаланином, либо тем, что увеличение концентрации фенилаланина косвенно вызывает нарушения в микросреде липидного бислоя мембраны клеток и, как следствие, изменения состояния фермента. Таким образом, знание активности ЛХЭ и сс полиморфных модификаций, а также слежение за ее изменением в процессе заболеваний, позволит быстро подобрать эффективное лечение. Бутирилхолитюстераза БХЭ, Е. С. 3. Бутирилхолинэсгераза млекопитающих обнаруживается в сыворотке и плазме крови, белом веществе головного мозга, клетках спинного мозга, сердце, полосатых мышцах, поджелудочной железе, кишечнике, плаценте и других органах . Сывороточная БХЭ синтезируется в печени и оттуда поступает в кровоток. Наибольшее количество БХЭ сосредоточено в печени и в плазме крови. В норме активность БХЭ в крови человека лежит в диапазоне 0,9 Едмл но бутирилтиохолину , ,. БХЭ в организме присутствует в нескольких молекулярных формах. Сскрстируемый фермент представлен глобулярными, водорастворимыми гидрофильными формами , в2 и , которые состоят, соответственно, из одной мономер, двух димер или четырех тетрамер субъединиц. Субъединица фермента является сиалогликопротеидом с молекулярной массой кДа, состоящей из 4 аминокислот и 9 углеводных цепочек, на долю которых приходится веса белка. Углеводы располагаются на поверхности белковой глобулы и служат для защиты БХЭ от протеолиза. Субъединицы в димере связаны дисульфидными связями остатков цистеина. Найдено, что активности БХЭ плазмы приходится на долю тетрамеров. Последовательности АХЭ и БХЭ гомологичны на , их структура также сходна. Также как и в случае АХЭ, мономер БХЭ имеет гидрофобный карман глубиной А, содержащий каталитический центр фермента, включающий в себя эфирный и анионный сайг, а также периферический анионный центр, роль которых аналогична роли этих доменов у АХЭ. Эфирный сайт содержит в себе каталитическую триаду Бег 8,1Пя8, и7, участие которых в катализе такое же, как и в случае АХЭ . БХЭ специфична к эфирам холина, тиохолина и другим органическим эфирам. Она высоко специфична к бутирилтиохолину Км 0.