Мезопористые кремнеземы как носители для белков на примере гемоглобина и пероксидазы

• Автор: Овсянников, Роман Алексеевич
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Иммобилизация белков на твердых носителях.

Синтез и свойства мезопористых кремнеземных адсорбентов

1.1 Общие сведения

1.2 Методы иммобилизации ферментов

1.2.1 Необратимое связывание

1.2.2 Обратимое связывание

1.3 Особенности адсорбции белковых молекул

1.3.1 Термодинамика адсорбции

1.3.2 Химия поверхности носителя и фермента

1.3.3 Пористая структура носителя
1.4 Классификация носителей для иммобилизации ферментов
1.4.1 Природные высокомолекулярные соединения
1.4.2 Органические носители
1.4.3 Неорганические носители
1.5 Методы получения мезопористых кремнеземов
1.5.1 Принцип супрамолекулярного темилатирования
1.5.2 Регулирование размера пор
1.5.3 Синтез крупнопористых адсорбентов и создание вторичных мезопор
1.5.4 Модифицирование поверхности кремнезема
Глава 2. Иммобилизация белков на кремнеземных адсорбентах
2.1 Адсорбция белков на кремнеземных адсорбентах
2.1.1 Адсорбция белков на силикагелях и силохромах
2.1.2 Адсорбция белков на мсзопористьтх молекулярных ситах с одномерной системой пор МСМ, 8ВА и БМб
2.1.3 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с трехмерной системой пор МСМ
2.1.4 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с разупорядоченной структурой
2.1.5 Новые кремнеземные адсорбенты
2.2 Изотермы и кинетика адсорбции белков на кремнеземных адсорбентах
2.2.1 Изотермы адсорбции
2.2.2 Кинетика адсорбции белков
2.3 Свойства адсорбционных слоев ферментов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Объекты и методы исследовании
3.1 Синтез кремнеземных адсорбентов
3.1.1 Синтезы на основе немонотонных ПАБ
3.1.2 Синтезы на основе катионных ПАВ
3.1.3 Выбор носителей для адсорбции белков
3.2 Физикохимические методы исследования адсорбентов
3.2.1 Низкотемпературная адсорбция азота
3.2.2 Электронная микроскопия
3.2.3 ИК спектроскопия ,
3.2.4 Термопрограммированная десорбция аммиака
3.2.5 Термогравиметрия и дифференциальнотермический анализ
3.3 Исследование адсорбции белков
3.3.1 Адсорбаты
3.3.2 Адсорбционные измерения
3.3.3 Измерение концентрации гемоглобина и пероксидазы
3.3.4 Вычисление предельных величин адсорбции белков
3.3.5 Измерение ферментативной активности пероксидазы
3.3.6 Определение кинетических параметров пероксидазной реакции
3.3.7 Приготовление растворов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 4. Темттлатный синтез кремнеземов
4.1 Синтез в присутствии полиэтиленгликолей ПЭГ
4.1.1 Первичные синтетические процессы
4.1.2 Посгсинтстическая обработка
4.1.3 Детсмплатирование
4.2 Синтез бипористых кремнеземов в присутствии ЦТАБ
4.2.1 Формирование крупных пор в системе ЦТАББЮг при
4.2.2 Влияние концентрации ЦТАБ на текстуру материала
4.2.3 Изменение текстуры кремнезема при введении ТМБ
4.2.4 Влияние температуры на текстуру материала
4.3 Характеристика поверхности пористых кремнеземов
Глава 5. Адсорбция гемоглобина
5.1 Кинетика адсорбции
5.1.1 Двухстадийная кинетическая схема адсорбции белков
5.1.2 Обработка экспериментальных результатов
5.1.3 Кинетические закономерности адсорбции гемоглобина на кремнеземах
5.2 Изотермы адсорбции гемоглобина
5.2.1 Изотермы Ьтигш
5.2.2 Изотермы адсорбции на бипористых кремнеземах и алюмосиликатах
5.3 Свойства кремнеземов после адсорбции гемоглобина
5.3.1 Данные низкотемпературной адсорбции азота
5.3.2 Данные ИК спектроскопии
5.4 Зависимость предельной адсорбции от размера пор адсорбента
5.5 Г смог л об и н как тестовый белок для оценки поверхности адсорбентов
Глава 6. Адсорбция и каталитические свойства пероксидазы
6.1 Адсорбция пероксидазы на мезопористьтх кремнеземах
6.1.1 Изотермы адсорбции и предельные величины адсорбции
6.1.2 Механизм адсорбции
6.2 Свойства адсорбционных слоев пероксидазы
6.2.1 Данные ИК спектроскопии
6.2.2 Активность фермента в адсорбционном слое
6.2.3 Параметры уравнения МнхаэлисаМентен
6.3 Адсорбция гемоглобина и пероксидазы сравнительная характеристика
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Сравнительные характеристики основных методов иммобилизации приведены в табл. Необратимым называется прочное связывание, после которого невозможно отделение иммобилизованного фермента от носителя без разрушения одного иили другого. Наиболее распространенными процедурами необратимой иммобилизации ферментов являются ковалентное связывание, включение в гели, микрокапсулирование и поперечная сшивка рис. Ковалентное связывание фермента с поверхностью носителя является одним из наиболее распространенных методов иммобилизации. Молекулы белка при этом прочно удерживаются на поверхности и не переходят в раствор при проведении реакции. Чаще всего ковалентное связывание задействует следующие группы на поверхности белка ттаминогруппу лизина тиогруппу цистсина карбоксильную группу аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Выбор молекулысшивки определяется химией поверхности носителя , . Активные группы на поверхности носителя можно создавать как постсинтетически, так и в процессе синтеза . Разнообразие молекулмодификаторов делает количество комбинаций иосительсшивка белок практически безграничным. В качестве примера на рис. В этом случае белок связывается с поверхностью через изоуретановую группу . Рис. Прочность образующихся связей белка с носителем сравнима с прочностью внутренних связей в молекуле фермента, что делает невозможной регенерацию носи теля после дезактивации катализатора. Еще один недостаток метода ковалентного связывания существенная потеря активности фермента в том случае, если химическая модификация затрагивает аминокислотные остатки, определяющие 1еометрию активного центра. Одним из вариантов решения этой проблемы является проведение процедуры иммобилизации в присутствии аналогов субстрата . При иммобилизации методом поперечной сшивки молекулы белка химически связываются между собой, образуя различные поперечносшитые структуры рис. Для сшивки часто используются толуолдиизоцианат или глутаровый альдегид. Рис. Различные способы поперечной сшивки ПС ферментов а кристаллизация, б агрегирование, в распылительная сушка, д прямая сшивка. Среди недостатков метода можно отмстить токсичность используемых реагентов, стеричсские затруднения, возникающие при образовании крупных агрегатов молекул. Для решения этой проблемы адсорбцию проводят совместно с нейтральным белком, альбумин, желатин , или полисахаридами амилоза, гепарин , . Это позволяет сохранить удельную активность фермента, увеличить его стабильность и снизить расход. Фермент механически захватывается внутрь ячеек гелей , мембран или полых полимерных волокон , размеры пор которых таковы, что задерживают крупные белковые глобулы, но позволяют проникать внутрь молекулам субстрата и продуктов реакции. При микрокапсулировании происходит захват белковых молекул внутрь полиамидных или нитроцеллюлозных микрокапсул диаметром 0 мкм или липосом . Этот метод особенно интересен для создания материалов для адресной доставки лекарственных средств. Благодаря отсутствию химической модификации поверхности белка методы включения в гели позволяют сохранить относительно высокую активность фермента. Однако практическое применение метода ограничивают диффузионные затруднения, обусловленные ячеистой структурой гелей и полимерных сеток . Обратимой называется иммобилизация, при которой возможно недеструктивное снятие молекул фермента с ноеггтеля в мягких условиях. Особенную важность обратимые методы приобретают для иммобилизации ферментов с подвижной структурой и для биоаналитических систем . Простейшим методом обратимой иммобилизации является адсорбция, при которой связывание фермента осуществляется посредством водородных связей, вандерваальсовых и гидрофобных взаимодействии. Энергия отдельных взаимодействий невысока, однако благодаря образованию множества контактов происходит многоточечное связывание и молекула белка связана с поверхностью достаточно прочно. Структура фермента в поверхностном слое по сравнению с исходной формой меняется незначительно, благодаря чему сохраняется существенная часть активности нативного фермента ,, , .