Свойства ферментов, включенных в нестехиометричные полиэлектролитные комплексы

• Автор: Шерстюк, Светлана Федоровна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 165 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. V

1. РЕГУЛЯЦИЯ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ

ШИ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА ПОЛИЭЛЕКТРОЖТАХ

1.1. Влияние иммобилизации на полиэлектролитах

на кинетические свойства ферментов

1.2. Положительная и отрицательная коодеративность

при низкой ионной силе

1.3. Влияние полиэлектролитного окружения на специфические взаимодействия между белками.

1.4. Регуляция стабильности ферментов синтетечес

кими водорастворимыми полимерными носителями
1.5. Влияние иммобилизации на полиэлектролитах на термодинамику обратимых ферментативных реакций.
2. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ ДЛЯ ИШСШЛИЗАВДИ
БЕЛКОВ.
2.1. Нековалентные комплексы, включающие синтетические поли электролиты и биополимеры
2.2. Обратиморастворимые ферментативные системы.
3. НОВЫЙ КЛАСС КОМПЛЕКСНЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОДИТОВ.
4. ЭКСПЕШМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
4.1. Материалы.
4.2. Методы.Модификация ферментов сшивающими агентами.
4.3. Связывание ферментов с поликатионом ПБП.
4.4. Выделение ферментов, связанных о доли
катионом
4.5. Связывание ферментов с полианионом ПМАК
4.6. Выделение ферментов, связанных с полианионом
4.7. Определение активности ферментов.
4.8. Получение фазовой диаграммы системы поликатионполианион.
4.9. Измерение размеров коллоидных частиц.
4Светорассеяние растворов полимеров.
4Титрование нативного и иммобилизованного в полиэлектролитные комплексы Ххимотрипсина основным панкреатическим ингибитором трипсина
4Термоинактивация нативных ферментов
4Термоинактивация иммобилизованных ферментов
4Нековалентное комплексообразование ферментов с полиэлектролитами
5. СВОЙСТВА НЕСТЕХИ МЕТШЧНЫХ ПОЖЭЛЕКТРОЖТНЫХ
КОМПЛЕКСОВ НПЭК.
5.1. Фазовые диаграммы растворов НПЭК.
5.2. Свойства нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, содержащих ферменты
6. ВЛИЯНИЕ ФАЗОВЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ В РАСТВОРАХ
НЕСТЕХИ СМЕТШЧШХ ПОЖЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ
НА КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИММСЕИЖЗОВАНШХ
ФЕРМЕНТОВ.
6.1. Гидролиз низкомолекулярных субстратов.
6.2. Влияние полиэлектролитного окружения на
белокбелковые взаимодействия.
7. ВЛИЯНИЕ ФАЗОШХ ПРЕВРАЩЕНИЙ В РАСТВОРАХ НПЭК
НА ТЕШСИНАКТИВАЦИЮ ИММ0ШЛИВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТШХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ВЫВЕДЕНИЯ ФЕВЛЕНТА ИЗ СФЕШ РЕАКЦИИ
8.1. Выведение фермента из реакционной смеси, используя нестехиометричный ПЭК2
8.2. Использование стехиометричного комплекса
состава I для аналитических целей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Многие исследователи показали, что рНпрофили активностей полианионных производных различных ферментов, действующих на их специфические низкомолекулярные субстраты, смещаются при низкой ионной силе 0, в более щелочную область на 1,02,5 единицы по сравнению с нативными ферментами . Поликатионные производные тех же ферментов проявляют обратный эффект, т. Нпрофили активностей в более кислую область , . Эти эффекты исчезают при высокой ионной силе г1, что указывает на электростатическую природу наблюдаемых явлений. Экспериментальные и теоретические исследования , , продемонстрировали, что с заряженными субстратами электростатическое влияние полимерного носителя проявляется и в увеличении или уменьшении наблрдаемой константы Михаэлиса. Изменение кажущейся величины исчезает при высокой ионной силе. Для полианионных и поликатионных производных ферментов при использовании незаряженных субстратов были получены величины Км, подобные величинам для нативных ферментов , . Упрощенную, но очень ясную интерпретацию этих результатов предложил Со С. И О. Больцмана Т абсолютная температура 2 положительное или отрицательное число, равное I в случае ионов Н. Зависимость ферментативной активности от обычно описывается диссоциацией ионизируемых групп, принимающих участие в ферментативном катализе . Поэтому, наблюдаемые сдвиги рНзависимостей могут быть обусловлены кажущимся сдвигом рК ионогенных групп каталитического центра фермента вследствие разницы в концентрации протонов в сфере полиэлектролита и в растворе. Однако, возможно альтернативное объяснение смещения рНпрофилей активностей полиэлектролитных производных ферментов изменение константы ионизации ионогеиных групп фермента под действием электростатического поля микроокружения. Величина внешнего раствора монет быть измерена потенциометрически при помощи обычного стеклянного электрода фазы носителя непосредственно измерить нельзя, но можно извлечь из сравнения рНпрофиля активности фермента, связанного с полиэлектролитом, и свободного фермента. СГ2 1. В этой таблице дрН , дают различия в величинах , при которых трипсин и ШЕТ показывают максимальной активности. Концентрация ионов водорода в отрицательно заряженном полиэлектролитном геле выше, а в положительно заряженном поли электролитном геле ниже, чем во внешнем растворе. Величины V , рассчитанные из дрН см. I, являются величинами того же порядка, что и рассчитанные из лолиэлектролитной теории для практически ионизированного поли
электролита типа сополимера малеиновой кислоты и этилена. Так, для ионизации полиметакриловой кислоты было сообщено У 0 мВ при 0,2 М ЫаС1 У 0 мВ при 0, М ДаС1 Г мВ при 0, М ЯаС1 мВ при ОД М НаС1. В работе впервые была дана количественная оценка поверхностного потенциала мембранной поверхности гладких микросом, выделенных из печени крыс. Плотности поверхностного заряда были определены методом изменения поверхности мембраны, вызываемом солью. Предполагается, что основными группами, определяющими заряд, являются карбоксильные группы белков. Полученные экспериментальные данные, обработанные в рамках теории Стой Сартп дают величину поверхностной плот
ности заряда I элементарный заряд на 6 А и число карбок
сильных групп 3. А . Отсвда видно, что биополиэлектролиты способны развивать сильные электростатические взаимодействия. И действительно, заряженные группы на внешней поверхности липидного двойного слоя мембраны эритроцитов человека могут определять форму клеток . В работе показано, что ферментативная обработка фосфолипазой и фосфолипазой Д мембранного липидного бислоя дает дополнительные диссоциированные полярные группы на внешней поверхности мембраны, что приводит к изменению форш эритроцитов за счет расширения или сжатия внешнего мембранного слоя относительно внутреннего. В работе предполагается, что электростатическое поле заряженного носителя влияет и на распределение заряженного низкомолекулярного субстрата. Д. заряд, который несет субстрат. К СЗ. Это уравнение показывает, что когда 2 к Т одного знака, т. Потенциал мВ, рассчитанный из л рК см.