Использование пенициллинацилазы в водной среде для получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных

• Автор: Кудрявцев, Павел Александрович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .

1.1 Пенициллинацилаза

1.1.1 Общие свойства и механизм катализа.

1.1.2 Субстратная специфичность и стереоспецифичность.

1.2 Пенициллинацилаза в реакциях ферментативною гидролиза.

1.2.1 Получение ядер антибиотиков.

1.2.2 Высокоспецифичный гидролиз фенилацетильных производных амипосоодинений

1.3 Пенициллинацилаза в реакциях ферментативного синтеза

1.3.1 Реакции активированного ацильного переноса
1.3.2 Реакции прямой конденсации
1.4 Применение гидролаз в синтетических целях.
1.4.1 Способы увеличения выхода продукта синтеза при использовании гидролаз.
1.4.2 олучение ацильных производных аминов
1.4.3 Получение энантиомеров спиртов и аминов.
1.4.4 Хемо и региоселективность гидролаз в реакциях синтеза
1.5 Химические методы хемо и региоселсктииного синтеза амидной связи.
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1 Материалы.
2.2 Методы
2.2.1 Определение активности пенициллина щлазм
2.2.2 Определение компонентов реакционной смеси методом ВЭЖХ.
2.2.3 Определение энлнтиомерной чистоты аминососдинсмий
2.2.4 Получение Мацильных производных Бцистсина и глутатиона методом ферментативного ацильного переноса.
2.2.5 Химическое феиилацетилирование.
2.2.6 Разделение энантиомеров фенилглицинола.
2.2.7 Разделение энантиомеров Iфенилпропиламина.
2.2.8 Разделение энантиомеров транс2аминоциклогексанола.
2.2.9 Разделение энантиомеров норвалина
2.2. Получение медною комплекса ЗЬуя
2.2. Ферментативное получение еМРЬасЭЬуз.
2.2. Получение ТГПпроизводных аминоспиртов
2.2. Снятие ТГПзащиты с производных аминоспиртов
2.2. Химический синтез ароматических кетонов по реакции ФриделяКрафтса
2.2. Восстановительное аминирование кетонов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Кинетические закономерности реакции ферментатнвого ацилирования
3.1.1 Эффективность и стереоселсктивность ферментативного активированного ацильного переноса.
3.1.2 Синтез амидной связи с помощью реакции прямой конденсации
3.2 Хсмосслсктиинаи конденсации нолифункциональных субстратов, катализируемая нснициллинаиилазой в водной среде.
3.2.1 Синтез хиральных Мацильмых производных цистеина.
3.2.2 Синтез хиральных цилыыx производных глутатиона.
3.2.3 Региосслективное ацилировамие лизина.
3.3 Разработка метода определении оптической чистоты первичных аминососдиисний ка основе впервые полученных 1реагснтов.
3.3.1 Новые БНреагенты для хирального ВЭЖХ анализа с предколоночмой модификацией
3.3.2 Разработка метода ВЭЖХ анализа эпантиомеров первичных аминосоединений.
3.3.3 Реакция модификации в условиях избытка аминокомпонеша новый способ анализа энаптиомеров тиолов.
3.4 Реакции ацильного переноса на аминокислоты и их производные.
3.4.1 Реакции ацилирования валина и его эфиров.
3.4.2 Реакции ацилирования ааминопентановой и ааминогексановой кислот.
3.5 Реакции ацильного переноса на аминоспиргм.
3.5.1 Стереоселективное ацилировамие аминоспиртов с концевой ОМ группой.
3.5.2 Стереоселективное ацилировамие аминоспиргов с неконцевой ОН группой.
3.6 Реакции ацильного переноса на амины.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Согласно кинетическим исследованиям, заместители в альфа положении боковой цепи в большей степени ухудшают сродство к субстрату. Изменение длины цепи или введение заместителей в бензольном кольце отрицательно влияют на обе составляющие константы специфичности. Так среди производных фенилуксусной кислоты наиболее активными субстратами являются амиды и эфиры феноксиуксусной кислоты, фенилглицина, миндальных кислот. Наименее активны субстраты с большим заместителем в ацильной части . Исключение составляют, пожалуй, только пара гидрокси замещенные производные фенилуксусной кислоты, обладающие лучшим сродством к ферменту в случае тех ПАз, на дне гидрофобного кармана которых находится гидроксильная группа серима В8ег, структура 1А комплекс ПА из Е. Н с парагидроксифенилуксусной кислотой. В то же время фермент обладает широкой субстратной специфичностью к амидной части и эффективно катализирует гидролиз Мацильиых производных разных классов аминосоединений , . Систематическое исследование субтратной специфичности ПА из Е. Н и Л. Па , позволили предложить трехцентровую модель связывания субстрата в активном центре фермента Схема 1. Мфспилацетильными производными аминокислот рЗ. Схема 1. Трехточечная модель связывания энантиомеров субстрата в активном центре Г1А на примере РЬасРЬд А правильное РИасКР и 1 неправильное РИас0Р1щ расположение структурных фрагментов оиа1ггиомсров субстрата в активном центре фермента р1 участок связывания ацильной части, р2 участок связывания бокового радикала аминокислоты, рЗ участок связывания карбоксильной группы. Участок р1 представляет собой жесткий гидрофобный карман, в котором реализуются сильные гидрофобные взаимодействия, определяющие высокое сродство ПА к производным ФУК. Субстраты, обладающие ионогенными группами, например производные фенилглицииа, подвергаются ферментативному превращению исключительно, когда эти группы находятся в нейтральной форме. Интересной иллюстрацией этого факта является то, что прохиральный диметиловый и диэтиловый эфиры фенилмалоновой кислоты стереоселективпо гидролизуется ИЛ по одной из эфирных групп. Образующийся в ходе реакции моноэфир, обладающий отри нагельным зарядом за счет дспротонированной карбоксильной группы, не подвергается дальнейшему гидролизу . Скорость реакции всего на порядок уступает гидролизу эфиров Ямиидальиой кислоты, при этом метиловый эфир фенилмалоновой кислоты примерно в 4 раза более реакционно способен, чем этиловый. Оптическая чистота образовавшегося моноэфира в обоих случаях превышала , что соответствует значению стереоселективности более 0. Несмотря на высокую специфичность к остатку фенилуксусной кислоты и ее производных при подходящей геометрии субстрата ПА оказывается способной катализировать гидролиз производных кислот, не содержащих ароматических радикалов. Недавно путем обширного скрининга было найдено, что ПА с низкой активностью, но высокой стереосслсктивностыо гидролизует эфиры 2,2диметил 1,3диоксан4карбоновой кислоты Схема 1. Схема 1. Энантиоселективный гидролиз эфира 2,2диметил 1,3диоксан4карбоиовой кислоты, катализируемый ПА из Е. Участок связывания уходящей группы, в отличие от участка связывания ацильной части субстрата характеризуется развитой микрогетерогенностью, так как введение заряженных или полярных замстителей может привести к увеличению эффективности катализа . На участке р2 реализуются слабые гидрофобные взаимодействия, эта область болсс чувствительна к стерическим препятствиям. Систематические исследования выявили, что наиболее специфичными субстратами являются Ыацильные производные Ьаамипокислог и их элсменторгамические аналоги с отрицательным зарядом на месте карбоксильной группы. Это объясняется наличием положительного заряда в участке рЗ. Стсреосслактивность ПА определяется способностью субстрата располагаться на участках р2 и рЗ, при жссткозакреплсиной ацильной части на участке р1 может значительно отличатся у ферментов из различных источников. Гак ПА из Е. П энантиоизбиратсльна по отношению к Ыацильным производным ааминокислот. ПА, 7.