Липазы в системе обращенных мицелл : Роль межфазной поверхности в регуляции липолитической активности ферментов

• Автор: Павленко, Иванна Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 184 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. ЛИПАЗА СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА.

1.1. Общая характеристика липаз из разных источников.

1.2. Аминокислотный и углеводный составИ

1.3. Структура активного центра и поверхностная активация липазы

1.4. Механизм катализа и кинетические модели действия липаз.

1.5. Факторы, влияющие на липолнз.

1.6. Субстратная специфичность липаз

1.7. Методы определения активности липаз
1.8. Применение липаз.
II СИСТЕМЫ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ, ИХ ДОСТОИНСТВА
2.1 Системы обращенных мицелл, общие характеристики.
2.2. Ферменты в системах обращенных мицелл регуляция их активности и олигомерного состава
2.3. Катализ липазой в системах обращенных мицелл.
III. ЛИПОКСИГЕНАЗА СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА.
3.1. Нахождение в природе, кататизируемые реакции и биологическая важность липоксигсназ
3.2. Структура активного центра и механизм катазнза липоксигсназ
IV. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОЛИФЕРМЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ
ПОСТАНОВКА ЗУДАЧ И.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
I. МАТЕРИАЛЫ
II. МЕТОДЫ
2.1. Характеристика препаратов ферментов
2.2. Определение катазитичсской активности ферментов
2.3. Химическая модификация ферментов.
2.4. Ссдиментационный аназиз
2.5. Изучение собственной флуоресценции липаз.
2.6. Изучение стабильности липаз
2.7. Синтез ацилированного ацикловира, катализируемый липазой в системе обращенных мицелл.
2.8. Изучение бифсрмснтной системы липаза липоксигеназа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ
1.1. Панкреатическая липаза свиньи
1.2. Липаза из Мисог пйекеи.
1.3. Липаза из СИготоЬас1егшт i
II. РЕГУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ.
2.1. Оптимизация условий катализа.
2.1.1. Зависимость каталитической активности липаз от среды, температуры реакции и концентрации фермента
2.1.2. Кинетические характеристики реакций, катализируемых липазами в водной среде и в системе обращенных мицелл
2.1.3. Влияние ионов кальция и желчных солей на липолиз в водном растворе и в системе обращенных мицелл
2.2. Регуляция олигомерного состава липаз в системе обращенных мицелл.
2.3. Регуляция активности липаз изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл.
2.4. Химическая модификация липазы.
2.5. Собственная флуоресценция липаз.
2.6. Предполагаемая локализация липаз в системе обращенных мицелл
III. СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПАЗ
IV. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ.
V. БИФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА ЛИПАЗА ЛИПОКСИГЕНАЗА.
5.1. Катализ соевой липокснгеназой1 в системе обращенных мицелл.
5.2. Кинетические характеристики бифсрмснтной реакции определение скорость лимитирующей стадии
5.3. Зависимости кинетических констант биферментного процесса от степени
гидратации и концентрации АОТ в системе обращенных мицелл.
5.4. Тестирование масел с помощью бифермеитной системы липаза
липокенгеназа
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Важным доказательством участия амфифилыюй петли в поверхностной активации липаз является установление отсутствия эффекта поверхностной активации для липаз, в структуре которых петля или отсутствует, или является очень короткой. Рнс. Конформационные изменения структуры липазы из i ii, вызванные поверхностной активацией фермента . Конформационные изменения включают смещение амифифильной петликрышки, открывающей активный центр фермента переход 1 2, а также формирование протяженной гидрофобной поверхности, отвечающей за связывание фермента с гидрофобным субстратом переход 3 4. Липаза из i также не проявляет поверхностной активации, что вызвано отсутсвием петли и необходимостью формирования открытой конформации фермента ,. Панкреатическая липаза морской свинки, имеющая амфифильную минипетлю, также не обладает свойством поверхностной активации . Еще одним ярким примером необходимости петли в процессе активации липаз явилось изучение поведения двух мутантов панкреатической липазы, один из которых не содержал все петлевые домены, а второй только апстлю, прикрывающую активный центр фермента . Оба мутанта имели очень низкую активность по отношению к эмульсии триглицерида по сравнению с нативной липазой, не активировались на поверхности раздела, гидролизовали водорастворимые субстраты с высокой скоростью, а также плохо связывались с субстратом в присутствии туарохолата натрия. На сегодняшний день известны структуры большого числа липаз, свидетельствующие об отношении липазы к семейству а гидролаз, состоящих из определенной последовательности аспиралей и листов . Однако, наиболее подробное описание структы следует привести для панкреатической липазы свиньи и липаз из ii и i vi v, изучаемых в данной диссертационной работе. Панкреактнческая липаза свиньи представляет собой гликопентид с молекулярной массой кДа, состоящий из 0 аминокислотных остатков ,. Структура имеет высокую степень идентичности со структурами панкреатических липаз человека и лошади . В отличие от многих панкреатических ферментов, секретируемых в виде профермента с последующей активацией, включающей протеолитическое отщепление небольшого пептидного участка, панкреатические липазы секретируются напрямую в виде активного фермента с молекулярной массой пептида кДа. Фермент содержит 6 дисульфидных мостиков 4 , 2, 82, 6 7, 0 5 и 4 0 и 2 свободных цистсина 4 и 2 ,. Структура включаег 2 домена ,,, Рис. З. концевой домен, образованный аминокислотными остатками 16, имеет структуру и содержит каталитический центр, состоящий из триады 3, 7 и i 4. Сконцсвой домен отвечаег за связывание с колипазой, необходимой для реактивации панкреатической липазы i viv см. Колипаза. РнсЗ. Ион Са2 расположен далеко от каталитического центра и, очевидно, не вовлечен напрямую в каталитический процесс. Повидимому, его основная роль заключается в координации петли 8 6 и стабилизации структуры фермента. Амфифильная петлякрышка, закрывающая активный центр фермента, состоит из х аминокислотных остатков 82 и в закрытой конформации линазы стабилизирована водородными связями с 5петлей остатки и р9петлей остатки 37 концевого домена. В результате контакта фермента с липидной поверхностью происходит поворот петликрышки приблизительно на в сторону Сконцевого домена и изгиб 5петли в противоположном направлении, что открывает активный центр и большую гидрофобную поверхность фермента А в длину и площадью 5А2, отвечающую за связывание с поверхности субстрата . Липаза из ii также является белком с молекулярной массой кДа. Единичная попипептидная цепь фермента, состоящая из 9 аминокислотных остатков, образует центральный лист, включающий 8 параллельных полос, соединенных между собой петлевыми и спиральными сегментами ,, Рис. Все связывающие петлевые сегменты иравоповернуты и расположены на одной стороне листа, что создает его необычную ассиметричность. Три дисульфидных мостика 8, и 5 4 и четыре циспептидные связи, предшествующие остаткам пролина, обеспечивают стабильность структуры фермента. Активный центр фермента состоит из триады 4 i 7 3, и скрыт под короткой амфифильной петлейкрьппкой, представляющей собой аспираль между и V . Рис. Структура липазы из М.