Механизм реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой пероксидазами

• Автор: Писарев, Владимир Викторович
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА

ПЕРОКСИДАЗ РАСТЕНИЙ.

1.1. Классификация и общая характеристика пероксидаз из различных источников

1.2. Структура цитохром с пероксидазы как исходной модели для изучения пероксидаз растений

1.3. Структура изофермента С пероксидазы хрена.

1.4. Структура изофермента Е5 пероксидазы хрена

1.5. Структура пероксидаз грибов.

ГЛАВА 2. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ

2.1. Каталитический цикл пероксидазной реакции

2.2. Функциональная важность отдельных компонентов пероксидазы для катализа.
2.3. Механизм инактивации пероксидазы в ходе реакции.
ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ЛЮМИНОЛА ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА,
КАТАЛИЗИРУЕМОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ.
3.1. Прсдстационарная и стационарная кинетика окисления люминола
пероксидазо й.
3.2. Механизм радикальных реакций фтатгидразидов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4.1. Материалы.
4.2. Методы
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РЕАКЦИИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛЮМИНОЛА И РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ ПЕРОКСИДАЗАМИ
5.1. Кинетические константы реакции окисления люминола Н2О2 катализируемой пероксидазами из разных источников
5.2. Изучение предстационарной кинетики совместного окисления люминола и различных производных фенола Н2О2, катализируемой пероксидазами из разных источников
5.3. Изучение стационарной кинетики реакции совместного окисления люминола и различных производных фенола Н2О2, катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена
5.4. Кинетика расходования субстратов в реакции индивидуального и совместного окисления люминола и различных производных фенола Н2О2 , катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена.
ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ,
КАТАЛИЗИРУЕМОЙ ЩЕЛОЧНЫМИ
ИЗОФЕРМЕНТАМИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.
6.1. Определение квантового выхода по люминолу в реакции усиленной хемишоминесценцни, катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена
6.2. Продукты реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена, для модельного субстрата
Ы,Ыдиметиламинолюминола
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ


Кинетика расходования субстратов в реакции индивидуального и совместного окисления люминола и различных производных фенола Н2О2 , катализируемой щелочными изоферментами пероксидазы хрена. ГЛАВА 6. ИЗОФЕРМЕНТАМИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА. Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая пероксидазами, широко используется в качестве детектирующей системы в аналитической биотехнологии. Реакция была открыта Крикой Иска 1 и позволила увеличить предел чувствительности анализов с использованием пероксидазы до М. В качестве усилителей может выступать широкий круг соединений, включающий производные 6гидроксибензотиазолов, замешенные фенолы, нафголы и амины. Механизм усиления до сих пор детально не изучен. Он может базироваться на субстратсубстратной активации, окислении усилителя и передаче окислительного эквивалента с радикала усилителя на люминол или усилении на постфсрментативных радикальных реакциях производных люминола. Нижний предел определения пероксидазы в качестве метки зависит от каталитических свойств пероксидазы в реакции окисления усилителя и люминола перекисью водорода. На сегодняшний день в качестве основного источника пероксидаз для промышленного применения предлагаются корни хрена. АпЬготусез гатозш 5. Целью данной работы является изучение механизма реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой различными пероксидазами в присутствии различных усилителей. Исследовать каталитические свойства различных пероксидаз в реакции окисления усилителя и люминола перекисью водорода. Изучить предстационарную и стационарную кинетику этой реакции для разных усилителей. Определить продукты реакции усиленной хемилюминесценции. Сформулировать критерии для поиска новых усилителей и пероксидаз с целью увеличения чувствительности анализа. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ПЕРОКСИДАЗ РАСТЕНИЙ. Классификация и общая характеристика пероксидаз из различных источников. В процессе эволюции живые организмы развили ферментные системы, которые используют пероксиды для выполнения специальных биологических целей или просто для удаления токсичных для организма перекисей 6. Пероксидазы КФ . Среди гсмсодержащих пероксидаз выделяют три суперссмейства пероксидазы растений, животных и каталазы. Следует отметить, что пероксидазы животных и растений принципиально различаются в структуре и механизме катализа. С другой стороны, среди суперсемейства пероксидаз растений имеется отдаленное родство. Среди суперсемсйства растений выделяют три класса пероксидаз класс I ССР, бактериальные пероксидазы, пероксидазы хлоропластов и аскорбат пероксидазы цитозоля класс II внеклеточная иероксидаза грибов класс III классические, секретируемые пероксидазы растений. Пероксидазы классов II и III содержат Са , дисульфидные мостики и в большинстве случаев боковые олигосахаридные цепочки. Пероксидаза один из наиболее широко распространенных ферментов растений. Однако только корни хрена могут быть источником коммерческой пероксидазы, поскольку содержат наибольшее количество фермента. И действительно, до недавнего времени лишь пероксидаза хрена была коммерчески доступным препаратом пероксидаз вплоть до появления грибной пероксидазы АпИготусея гатоБШ фирма Б итогу в году 5. Благодаря интенсивным биохимическим исследованиям пероксидаз, многое в структуре и функциях этих ферментов стало ясным. В Таблице 1. Д. Содержание олигосахаридов в молекуле фермента колеблется от 0 до , их присутствие приводит к значительному увеличению молекулярной массы фермента. Изучение изоферментного спектра пероксидаз растений позволяет заключить, что пероксидазы представлены кислыми р1 3,5 5,0, щелочными р1 7,,5 и суперщелочными р1 изоформами, которые всегда присутствуют во всех тканях растения в той или иной пропорции. Количественное содержание изопероксидаз зависит от вида ткани растений и воздействия внешних факторов. При определении пероксидазной активности и, в особенности, при расчете удельной активности следует помнить о различной субстратной специфичности кислых и щелочных изопероксидаз. Таблица 1. Свойства секвенированных и биохимически описанных пероксидаз.