Специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis

• Автор: Гуранда, Дорел Теодор
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с.

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Первичная структура и биосинтез пенициллинацилаз

1.2 Строение ненициллинацилазм i i по данным рентгеноструктурного анализа

1.2.1 Общая структура

1.2.2 Структура активного центра

1.2.3 Механизм катализа О

1.3 Субстратная специфичность пенициллинацилаз

1.3.1 Специфичность к ацильной маст и субстрата

1.3.2 Специфичность к уходящем группе

1.4 Стереоспецифичность действия пенициллинацилазы

1.1.1 Стереоспецифичность в раду фенилацетильных производных
а и амиокслот
1.4.2 Стсрсоспсцифичность в ряду фенилацетильных производных фосфоповых и
фосфиновых аналогов аминокислот
1.4.3 Стсрсоспсцифичность в раду ацильных производных первичных аминов,
вторичных спиртов и карбинолов
1.4.4 Стерсоспсиифичностъ к ацильной группе субстрата
1.5 Использование пенициллинлцилаз в реакциях синтеза
1.5.1 Ферментативный синтез лактамных антибиотиков
1.5.2 Ферментативное анилирование аминокислот, их эфиров и пептидов
1.6 Стабильность пенициллинацилазы
1.7 Роль ионов металлов в пеннциллинацилазах
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.2.1 Очистка пенициллинацилазы.
2.2.2 Химический синтез мап номеров фенмлаце сильных производных аминокислот
2.2.3 Определение активности пснициллнашлаз
2.2.4 Определение концентрации активных центров пецшлннашлаз
2.2.5 Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза методом
непрерывного р1статировании
2.2.6 Кинетическое изучение ферментативного прекращении бензилпенициллина в
широком концентрационном интервале
2.2.7 Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза цветных
субстратов ненициллннаци.заз
2.2.8 Ингибиторный анализ
2.2.9 Определение компонентов реакционной смеси методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
2.2. Анализ оптической чистоты препаратов
2.2. Определение концентрации свободных аминогрупп
2.2. Определение ккат гидролиза фенил ацетильных производных аминов,
аминокислот и их аналогов пол действием нениииллинацклаз
Х2. Определение кинетических параметров методом анализа кинетики одновременного
превращения нескольких субстратов, катализируемого одним фермешом
2.2. Слежение за ферментативным гидролизом рацемических смесей
фенилацетильных производных аминов и аналогов аминокислот
2.2. Исследование рНзависимостп кинетических параметров
2.2. Изучение Нзав не им ост и стабильности пенициллинацилазы из А.аесаИч
2.2. Изучение влияния ионов металлов на стабильность пеннциллннацнлаз
2.2. Исследование рНзависимости соотношении скоростей синтсзагилролиза
в реакции ферментативно о синтеза ампициллина
2.2. Слежение за реакцией синтеза ацильных производных аминов и аминокислот метолом ферментативного переноса ацильной части активированного донора
2.2. Прямая конденсация фенилу косной кислоты и аминов, кат ализируемая
пенициллмнацнлазой из А.аесах
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Роль иона металла в действии иеиициллинацилаз
3.2 рНЗависимость инактивации пеннциллннацнлаз
3.3 Зависимость каталитической активности от
3.4 Ингибирование ферментативной активности субстратом
3.5 Субстратная специфичность и стереоспецифичностъ енциллиац.а
3.5.1 Активный центр мсницил ншаннлазм
3.5.2 Изучение .пастка связывания ацильной части субстрата р1
3.5.2.1 Ингибирование пеннцнллнканилаз производными фсннлуксусной кислоты
3.5.2.2 Ингибироиание пеницнллннацилаз алифатическими и ароматическими
спирташ
3.5.3 Тпрппаше активных центров
3.5.4 Вмсокоспсцпфнческне субстраты для определения активности
пеннциллмнацнлаз
3.5.5 Субстратная специфичность
3.5.6 Изучение участка связывания боковой группы субстрата р2
3.5.7 Изучение участка связывании карбоксильной группы субстрата рЗ
3.5.8 Стереоспецифичностъ пеницнллннацилаз в ряду фенмлацетильнмх
производных аминокислот ЮЗ
3.5.9 Специфичность и стерсоснсинфичность в ряду рфснилаистнльных
производных карбоновых и фосфоновых аналогов аминокислот
3.5. Хиральная дискриминация Гфснилацетидышых производных аналогов
аспарагиновой и глутаминовой кислоты
3.5. Специфичность и стерсоспсцнфгность в ряду фенил ацетильных
производных аминов
3.6 Пеннциллинацилазы в реакциях синтеза
3.6.1 Ферментативный синтез ампициллина
3.6.2 Ферментативное ацилированне аминов в водной среде
3.6.2.1 Фермент ативнаи конденсация фсннлуксусной кнелоты и аминов
3.6.2.2 Синтез ацильных производных аминов и схачинокнслог методом
ферментативного переноса ацильной группы
4 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращении
ПА пенициллинацшша
пнитромкарбоксианилид фснилуксусной кислоты
БП бензилпенициллин
ФУК фснилуксусная кислота
6АПК 6аминопенициллановая кислота
7ЛДЦК 7аминодезацетоксицефалоспорановая кислота
7ЛЦК 7аминоцсфалоспорановая кислота
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
фенилглицин
аРЕЛ афен и лэтилам и н
оФА офталевый альдегид
мэ меркаптоэтанол
дмсо днметилсул ьфо ксид
а к. аминокислота
индекср фосфоновый аналог аминокислот например,
индекс фосфиновый аналог аминокислот например,
Е стереоспецифичность ЕкстКм1каКм
оптическая чистота непрореагировавшет субстрата
еер оптическая чистота продукта ессксскс
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
РСА рентгеноструктурный анализ
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭГТА этиленгликольбис2аминоэтилЫ,1,КЫтстрауксусная кислота
вое третбутилоксикарбонильный радикал
бензильный радикал
Введение
Актуальность


I. Устранение сигнального пептида является первым шагом в серии событий процессинга, ведущих к периплазматически локализованной ПА У. Затем предшественник проходит через цитоплазматическую мембрану в пер и плазматическое пространство и только после этого происходит специфическое расшепление предшественника на субъединицу и асубъединицу, связанную с эндопептидом. До настоящего времени также определены первичные структуры методом секвенирования гена ПА из А. Их, К. ИгорИИа, Р. Иеп , А. Н.теЫепит и показано, что эти ферменты обладают высокой степенью гомологичности. Авторы сопоставили их аминокислотные последовательности и обнаружили много высококонсервативных участков на протяжении как а, гак и 3цепи ферментов, большинство из которых, если исходить из трехмерной структуры ПА из КсоИ, находятся вблизи активного центра. В табл. I представлено сравнение первичной структуры ПА из различных микроорганизмов. Отметим, что Ыконцевой аминокислотный остаток 3цепи всех рассмотренных ПА является серии каталитический центр. Что касается ПА из А. Их, это один из наименее гомологичных ферментов п группе пенициллинОацилаз ферменту из КсоИ. Особенностью ПА из ЛаесаЛ. Этим авторы а объясняю значительную термостабильность ПА из А. ПА из одного микроорганизма экспрессироваться в клетках другой бактерии поддерживают данное предположение. Активные белки получены в результате клонирования и экспрессии в клетках Е. И гена ПА из А. И. и гибридного гена ПА, кодирующего асубъелиницу и эндопептид из К. ИгорИИа и рсубъединицу из Е. И . Свойства некоторых псниииллинСацилаз. ГЧ. Параметр А. Ич Е. К.сГгора п. Аулсо. Молекулярная масса зрелого фермента, кДа . Х5. Количество а. ДНК идентичность. Молекулярная масса, кДа . Количество а к. Идентичность а. Колотесгво а. Молекулярная масса. Да . Количество а. ФУК в качестве единственного источника углерода и энергии 3 аиилаза связана с белковым метаболизмом клетки V. Строение пенициллинацилазы из Е. Рентгеноструктурный анализ РСА ПА из ЕсоП был опубликован в году У. Кристаллическая струкгура ПА была определена многократными изоморфными перестановками при разрешении 1. А. Фермент имеет форму ночки в поперечном сечении, с глубокой чашеобразной выемкой по центру. Гетеродимер имеет усредненные размеры xxА и состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей. Отдельные субъединицы не связаны ковалентно IV. Для проявления ферментативной активности ПА из Е. И и Р. Иеп обязательно необходимы обе субъединицы. Рассмотрение РСА комплексов ПАФМСФ и ПАФУК , а впоследствии еще семи ферментингибиторных комплексов ,8. При связывании ингибитора его фен ил ацетильная часть погружается в этот гидрофобный карман, а карбоксильная группа ориентируется к растворителю и близка к каталитическому сериновому остатку И, расположенному в устье связывающего кармана Специфичность фермента к фен и л ацетильной группе объясняется комплементарностыо фенилацетильного остатка и участка связывания ацильной группы субстрата активного центра фермента. Сравнение карт электронной плотности ферментлигандных комплексов и исходного белка свидетельствует о том, что пространственное расположение аминокислотных остатков ПА в свободной форме и в комплексе с рассмотренными ингибиторами мало отличается в пределах 0. А, за исключением области
. Структура комплексов ПА i . При связывании некоторых лигандов происходят конформационные изменения в активном центре ПА. В зависимости от структуры лиганда аминокислотные остатки а6 и а 5 могут находиться в двух энергетически выгодных пространственных положениях рис. Структуры комплексов ферментингибитор могут быть разделены на две подгруппы. Подгруппа 1 включает комплексы ПА с тиофенуксусной кислотой, ФУК, фенолом и пгидроксиФУК. При связывании этих лигандов не наблюдается конфирмационных изменений в белке. В активном центре эти лиганды погружаются глубоко, тесно к боковому радикалу а. При этом один из атомов кислорода карбоксильной группы образовывает водородные связи с 1, атомом азота и О каталитического , а другой атом кислорода образует водородные связи с окружающими молекулами воды рис.