Регуляция активности иммобилизованных ферментов фазовым переходом полимерной матрицы-носителя

• Автор: Еремеев, Николай Леонидович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 333 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ФАЗОВЫЙ ПЕРЕХОД СТИМУЛЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ

МАТРИЦЫ

1.1. Теоретическое описание фазового перехода в гидрогелях.

1.2. Регуляция характеристик фазового перехода гидрогелей.

1.2.1. Влияние состава полимера и строения геля на критическую температуру и фазовый переход в термочувствительных гелях.
1.2.2. Влияние состава среды на критическую температуру и фазовый переход в термочувствительных гелях.
1.2.3. Мультирегуляция степени набухания и фазового перехода температурночувствительных гидрогелей.

1.3. Фазовый переход в поли4изопропилакриламиде

1.3.1. Изменение системы внутри и межмолекулярных взаимодействий при фазовом переходе в полиМизопропилакриламиде.
1.3.2. Изменение гидрофильногидрофобного баланса в полиНИПАА при фазовом переходе полимера.
ГЛАВА II. ТЕМПЕРАТУРНЫЙ КОЛЛАПС ПОЛИНИПАА ГЕЛЯ И ЕГО
ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
II. 1. Особенности кинетического поведения ферментов, иммобилизованных на термочувствительных полимерах.
.2. Влияние температурного коллапса полиНИПАА матрицы на
кинетические и равновесные параметры ферментативных реакций.
.2.1. аХимотрипсии
И.2.2. Щелочная фосфатаза из кишечника тюленя.
П.2.3. Уреаза.
II.3 Возможные причины аномального температурного поведения 9 ферментов в ходе коллапса термочувствительной матрицы
.3.1. Изменение коэффициента распределения субстрата.
Н.3.2. Уменьшение коэффициента диффузии субстратов
И.З.З. Диффузионные затруднения
II.3.4. Стерические ограничения
П.3.5. Уменьшение концентрации свободной воды в геле.
ГЛАВА Ш. КОЛЛАПС ПОЛИНИПАА ГЕЛЯ В СМЕСЯХ ВОДАДМСО И
ЕГО ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
1П.1. Ферменты в водноорганических смесях.
1.1.1. Влияние органического растворителя на спектральные свойства 4 белков
III. 1.2. Влияние органического растворителя на наблюдаемую кинетику 0 ферментативных реакций
III. 1.3. Механизм влияния органического растворителя на кинетическое
поведение ахимотрипсина.
П1.1.4. Кинетическое описание гидролиза сххимотрипсином Ыацетил
замещенных субстратов в водноорганической смеси.
Ш. 1.5. Концепция низкобарьерных водородных связей применительно к
функционированию нативных к иммобилизованных ферментов в водноорганических смесях.
Ш.2. Фазовый переход полиНИПАА геля в водноорганических смесях.
Ш.З. Влияние изотермического коллапса полиНИПАА геля в смесях
водаДМСО на кинетическое поведение иммобилизованного а
химотрипсина
1.3.1. Физические и кинетические характеристики ферментсодержащих полимерных матриц
1.3.2. Кинетическое поведение препаратов иммобилизованного ахимотрилсина
ГЛАВА IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОВЕРКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ
ПОЛОЖЕНИЙ
IV. 1. Температурное поведение нативного ахимогрипсина в смесях водаДМСО.
IV.2. Температурное поведение иммобилизованного в полиНИПАА ахимотрипсина в смесях водаДМСО.
IV.3. Температурный коллапс полиНИПАА матрицы и влияние ацильного заместителя на кинетическое поведение иммобилизованного ахимотрипсина.
IV.4. Включение иммобилизованного фермента независимой ферментативной реакцией
ГЛАВА V. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СТИМУЛ
ЧУВСТВИТЕЛЬПЫХ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ.
V Фоторегуляция НКТРводорастзоримого линейного термочувствительного полимера
V.2. Разделение и концентрирование белков
V.3. Сокращение продолжительности аналитического никла биосенсоров
V.4. Термоконтролируемое включениевыключение ферментативной реакции
V.5. Сопряжение ферментативной реакции с ответом стимулчувствительной матрицы.
ГЛАВА VI. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
VI. 1. Исходные вещества
У1.2. Методы исследования
У1.2.1. Определение концентрации белка
У1.2.2. Титрование числа активных центров ферментов
У1.2.3. Определение активности нативных и иммобилизованных
ферментов
У1.2.3.1. аХимотрипсин
У1.2.3.2. Трипсин
1.2.3.3. Уреаза
У1.2.3.4. Щелочная фосфатаза
У1.2.3.5. Ангиотензинпревращающий фермент
У1.2.3.6 Глюкозооксидаза
У1.2.4. Определение коэффициентов эксгинкции пнитроанилина и п
нитрофенола в водноорганических смесях У1.2.5. Определение параметров уравнения МихаэлисаМентен
У1.2.6. Синтез полимерных препаратов
VI.2.6.1. Синтез линейного сополимера НИПАА и СП
У1.2.6.2. Синтез гелей, не содержащих ферменты
У1.2.6.3. Синтез фсрментсодержащих гелей метод физического
включения
У1.2.6.4. Синтез ферментсодержащих гелей метод ковалентной
иммобилизации
У1.2.6.4. Синтез бнфермектсодержащего геля
У1.2.7. Приготовление суспензии геля
У1.2.8. Подведение материального баланса при иммобилизации
ферментов
У1.2.9. Изучение относительной степени набухания препаратов гелей
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Тем не менее, простота влияния структуры мономера на НКТР полимера и характеристики получаемой полимерной сетки набухание геля является только кажущейся и далеко не гак однозначна, как это следует из теории ФлориХаггинса. Действительно, основным постулатом данной теории является то, что температура фазового перехода в полимере контролируется гидрофобногидрофильным балансом его структуры см. Отсюда следует, что полимеры, обладающие одинаковым отношением гидрофильных и гидрофобных остатков, должны демонстрировать сходные температурные свойства. Тем не менее, свойства термочувствительных полимеров определяются в первую очередь взаиморасположением отдельных групп в структуре мономера. Подобное высказывание впрямую иллюстрируется данными табл. Таблица . Величины НКТР для некоторых акриловых сополимеров ный водный раствор, 9. Рисунок 1. Зависимость КТР от состава сополимера НИПАА акриламидом 2 Изтилакрил амидом 3 Мметилакриламидом 4 бутилакриламидом 5 Ытретбутилакриламидом 9. НКТР около С. Аналогичная ситуация наблюдается и в следующем ряду полимеров, синтезированных из структурных изомеров мономерных звеньев полиЬлизин не проявляет термочувствительных свойств, НКТР для полиЫнпропилакриламида составляет С , 3, для полиЫизопроиилакриламида С 7, 8, а для полиГМвинилизобутирамида С 1,2. Рассмотрим более подробно влияние структуры мономерного звена на термочувствительные свойства соответствующих гелей. Сравним, например, поведение полимерных сеток из полиметилового эфира метакрилоилЬаланииа, МАА1аОМе и полиМметиламида метакрилоилмолочной кислоты, МАЬасЬтМе. В боковой цепи эти полимеры содержат одинаковые функциональные группы простые амидные и эфирные группы, а также боковую и терминальную метальные группы, что, на первый взгляд, должно обеспечивать сходный гидрофильногидрофобный баланс полимерной цепи. Различие в структуре боковой цепи заключается в местонахождении амидной и эфирной группировок в МАА1аОМе они находятся в противоположном взаиморасположении по сравнению с МАЬасЫМе. Такие небольшие различия в структуре мономеров приводят, тем не менсс, к значительным различиям в поведении получаемых из этих мономеров полимерных сеток рис. МАА1аОМе довольно сильно набухает между 0 и С и коллапсирует выше С. Температура перехода Ткр для него составляет ,С. ПолиМАЬасМе при 0С набухает практически в два раза хуже и Тф в данном случае находится в районе С. Рисунок 1. Зависимость относительного набухания гидрогелей полиМАА1аОМе и полиМАЬасКМе от температуры . В работе было исследовано равновесное набухание сополимеров МАА1аОМе с этиловым эфиром метакрилоилЬаланина МАА1аОЕО или метилового эфира мстакрилоил2аминомасляной кислоты МААЬиОМе. Эти вещества также являются структурными изомерами, различающимися положением этильной группы в МААЬиОМе эта группа находится несколько ближе к основной цепи по сравнению с МАА1аОЕ. Поведение гелей из сополимеров этих соединений довольно сильно различается. Набухание полиМАА1аОМесоМАА1аОЕ0 вначале слабо уменьшается с повышением содержания МАА1аОЕц после чего довольно резко падает. Точка перехода при 0С соответствует моль. МАА1аОМе. С другой стороны, для полиМАА1аОМссоМААЬиОМе уже небольшие добавки МААЬиОМе довольно сильно понижают степень набухания геля и точка перехода соответствует моль. МАА1аОМс. Таким образом, взаиморасположение сходных структурных мотивов в боковых цепях полимера то есть система внутримолекулярных водородных связей имеет определяющее влияние на термочувствительные характеристики соответствующих гидрогелей. Величина равновесной степени набухания геля обратно пропорциональна концентрации сшивающего агента . Увеличение концентрации сшивающего агента снижает критическую величину параметра взаимодействия между полимерной цепыо и растворителем х ПРИ достижении которой происходит коллапс . В терминах статистической теории Флори увеличение концентрации сшивающего агента приводит к уменьшению длины эффективного сегмента цепи Ь, и, следовательно, к уменьшению параметра 8, в результате чего резкий фазовый переход становится протяженным см.