Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus

• Автор: Семенова, Маргарита Викторовна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ. б

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурные полисахариды клеточных стенок растений

1.1. Строение пектина.

1.1.1. Основная цепь пектина.

1.1.2. Боковые цепи пектина

1.1.3. Нсуглеводные заместители в пектине

Глава 2. Биодеградация пектина

2.1.олигалактуроназы

2.1.1. Гены, кодирующие синтез полигалактуроназ

2.1.2. Структура и механизм действия полигалактуроназ

2.1.3. Биохимические свойства эмдополигалактуроназ . i.
2.2. Пектинэстеразы.
2.2.1. Структура и механизм действия пектинэстераз.
2.2.2. Влияние различных факторов на активность пектинэстераз
щ 2.3. Пектини пектатлиазы.
2.3.1. Структура и механизм действия пектин и пектатлиаз
2.3.2. Биохимические свойства пектин и пектатлиаз.
Глава 3. Распространение в природе и использование пектиназ.
Глава 4. Грибы рода i.
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 5. Объекты исследования и методика эксперимента.
5.1. Материалы
5.1.1. Микроорганизмы и условия культивирования
5.1.2. Ферментные препараты
5.1.3. Субстраты и реактивы
5.2. Хроматографическое разделение препаратов и выделение ферментов.
5.3. Определение концентрации белка.
5.4. Определение биохимических характеристик ферментов
5.5. Методы определения активности ферментов
5.5.1. Определение активности к полисахаридным субстратам
5.5.2. Определение активности к лнитрофенильным производным сахаров
5.5.3. Определение иектинлиазной активности
5.5.4. Определение пектинэстеразной активности.
5.5.5. Вискозиметрический метод определения общей пектиназной активности.
5.6. Определение кинетических параметров действия ферментов.
5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от и температуры.
5.8. Изучение и термостабильности ферментов.
5.9. Исследование изменения ММР продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.
5 Проведение гидролиза пектинов иод действием ферментов.
5 Массспектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков
5 Опенка способности ферментов к осветлению яблочного сока
5 Оценка способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов.
1. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 6. Поиск и создание продуцентов пектмназ
6.1. Мутагенез и селекция гриба А. аротси.
6.2. Сравнение ферментного состава препаратов на основе исходного и мутантного штаммов А. аротст
6.3. Мутагенез и селекция гриба А. осПси.
Глава 7. Выделение гомогенных пектмназ
7.1. Выделение пектиназ А. ароп1сих.
7.1.1. Очистка полигалактуроназы
7.1.2. Очистка пектинэстеразы.
7.1.3. Очистка иектинлиазы
7.2. Выделение пектиназ А.оеМш.
7.2.1. Очистка полигалактуроназы
7.2.2. Очистка пектинэстеразы.
7.3. Анализ препаратов А. гляег и выделение основных пектиназ.
7.3.1. Субстратная специфичность препаратов А. тег.
7.3.2. Аналитическое фракционирование препарата А. тег.
7.3.3. Препаративное разделение препарата А.
7.3.4. Очистка полигалактуромаз.
7.3.5. Очистка пектинэстеразы.
7.3.6. Очистка пектинлиазы
Глава 8. Идентификация пектиназ с помошью массспектрометрического
анализа их трипсиновых гидролизатов.
Глава 9. Свойства выделенных пектиназ.
9.1. Субстратная специфичность и кинетические параметры действия ферментов
9.2. Влияние температуры и на активность и стабильность пектиназ.
9.3. Изучение механизма гидролиза пектинов под действием полигалактуроназ и
псктинлиаз.
Глава . Взаимодействие ферментов при действии на пектины.
.1. Явления синергизма и антагонизма в системах полигалактуроназа
пектиюстераза и пектинлиаза пектинэстераза
.2. Глубокий гидролиз пектинов
.2.1. Гидролиз пектинов под действием индивидуальных пектиназ
.2.2. Гидролиз пектинов под действием исходных препаратов i
.2.3. Взаимодействие пектиназ А РЕ Аи при глубокой деструкции пектинов.
.2.4. Взаимодействие пектиназ . i при глубокой деструкции пектинов
Глава . Испытании пектиназ i vi.
.1. Использование пектиназ для осветления яблочного сока
.2. Выявление способности пектиназных препаратов к увеличению питательной
ценности кормов i vi.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кроме того, текстура фруктов и овощей во время роста, созревания и хранения сильно зависит от количества и строения пектиновых веществ. Изучение пектинов из разных растительных источников показало, что молекулы пектина имеют основную цепь, состоящую из остатков а1,галактуроновой кислоты гомогапактуронан или гладкая область с вставками а1,2связанных остатков Ьрамнопнранозы рамногалактуронан или разветвленная область рис. Соотношение структурных элементов пектина варьирует в широких пределах и зависит от растительного источника табл. Например, доля гомогалактуронана в коммерческом пектине , а в случае пектина из сои близка к 0. Гомогалактупонан. Наиболее удачным методом выделения чистого гомогалактуронана считается кислотный гидролиз. Выделенный с его помощью гомогалактуронан имеет степень полимеризации СП от до 0 остатков галактуроновой кислоты по разным литературным данным . Рис. Схема строения лестина. ОЗацетилированнзя Эгалактуроновая кислота. Ма Ьрачноза, Са1 Огалактоза, Ага Ьарабнноза, Ху1 ксилоза. Таблица 1. Состав структурных элементов в природных пектинах, . Обнаружено присутствие. Его содержание высоко, например, в соевом пектине. Из пектина клеточных стенок платана в присутствии эндополигалактуроназы было выделено два пектиновых полисахарида рамногапактуронаны I и II . В отличие от заряженного гомогалактуронана, рамногзактуронаны содержат фактически все нейтральные сахара. Рамногапактуронан 1 состоит из чередующихся а1,2связанных остатков Ьрамнозы и а1,4связанных остатков Огалактуроновой кислоты. В зависимости от источника полисахарида, к рамнозильных остатков в положении присоединяются боковые ветви, длинной от 1 остатка галактозы до и более остатков арабинозы сахарная свекла, галактозы лен, чеснок, лук или их обоих соя, картофель. Особенностью этого полисахарида является также высокое содержание ацетильных групп, связанных с остатками галактуроновой кислоты в положениях иили . Ацетилирование рамногалактуронана зачастую приводит к ингибированию деполимеризующих его ферментов. Рамногалактуронан I был выделен также из риса, моркови, киви, томата . Рамногалактуронан II встречается в пектине клеточных стенок растений редко. В его структуре было обнаружено до различных сахаров, в том числе и редких например, апиоза. В отличие от рамногалактуронана I, включающего исключительно 1,2связи, в рамногалактуронане II остатки рамнозы соединяются 1. Пектин, содержащий рамногалактуронан II, был выделен из томата, яблока, капусты, картофеля . Интересно, что до сих пор не было найдено ни одного фермента, способного разрушать рамногалакту ронан II. Боковые цепи пектина преимущественно представлены остатками Огалактозы, Барабинозы, Оксилозы. Редко встречаются остатки Оглюкозы, Оманнозы, Бфукозы, Оглюкуроновой кислоты . Основные сахара боковых цепей пектина Огалактоза и Барабиноза образуют достаточно продолжительные последовательности гапактан, арабинан и арабиногалактан двух типов I и II, которые связаны с основной цепью через положения иили Брамнозы или иногда иили гапактуроновых остатков. Например, доля замещенных остатков галактуроновой кислоты в пектине семян рапса составляет , картофеля и лука в пектине листьев табака не было обнаружено замещения галактуроновой кислоты. Соотношение замещенных и незамещенных остатков рамнозы также варьирует в широких пределах в зависимости от природного источника в пектине клеточных стенок платана остатков рамнозы замещены боковыми цепями, яблок почти 0, листьев табака , моркови , капусты , винограда , свеклы , томатов . Арабинан разветвленный полисахарид, основная цепь которого построена из а1,5связанных остатков Барабинофуранозы. Остальные аБарабинофуранозидные остатки от 1 до 3 присоединены к атомам иили арабинозы основной цепи. Арабинан может иметь молекулярную массу до кДа. Пектины, имеющие арабинаны в боковых цепях, были выделены из яблок, сахарной свеклы, платана, семян рапса, абрикоса, моркови, капусты, лука, груши . Входящий в состав боковых цепей пектина галактан является слабо разветвленным полисахаридом. Его основная цепь построена из р1,4связанных Ф остатков Огалактопиранозы.