Влияние стимул-чувствительной полимерной матрицы на кинетические свойства иммобилизованного α-химотрипсина

• Автор: Беляева, Евгения Александровна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОКЗОР 8

1.1. Фазовый переход в стимулчувствитсльных полимерах

1.1.1. Изменение системы взаимодействий и степени гидратации при фазовом переходе в полиизопропилакриламиде

1.1.2. Теоретическое описание фазового перехода в стимулчувствитсльных гелях

1.1.3. Фазовый переход в полиНИПАА в водноорганических смесях.

1.1.4. Гидрофобные взаимодействия полиНИПАА с различными соединениями

при фазовом переходе в полимере

1.1.5.0собснности кинетического поведения ферментов, связанных с

термочувствительными полимерами

1.2. Ферменты в водноорганических смесях

1.2.1. Влияние органического растворителя на спектральные свойства белков.
1.2.2. Влияние органического растворителя на наблюдаемую кинетику ферментативных реакций
1.2.2.1. Влияние органического растворителя на величину Кт.
1.2.2.2. Влияние органического растворителя на величину к
1.2.3. Концепция низкобарьерных водородных связей в применении к функционированию сериповых протеиназ в водноорганических смесях
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .
2.1. Исходные вещества
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Определение концентрации активных центров ахимотрнпсина
2.2.2. Определение активности ахимотрипсина и трипсина.
2.2.3. Определение коэффициентов эксгинкции ншггроаннлина
н ннитрофенола в водноорганических смесях
2.2.4. Определение параметров ферментативного гидролиза
2.2.5. Синтез иммобилизованных препаратов ахимотрипсина и трипсина
2.2.6. Приготовление суспензии геля.
2.2.7. Подведение материального баланса при иммобилизации ахимотрипсина .
2.2.8. Изучение степени набухания фсрментсодержащих препаратов
полиНИПАА и полиААгслсй
2.2.9. Изучение стабильности иммобилизованного ахимотринсина.
2.2 Изучение циклической работы полиНИИААпрепаратов ахимотрипсина . Глава 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Некоторые характеристики ферментсодержащих полимерных матриц
3.1.1. Зависимость степени набухания матриц от концентрации ДМСО
в смеси и температуры.
3.1.2. Кинетические свойства иммобилизованных препаратов ахнмотрипсина
3.2. Влияние фазового перехода полнНИПААматрицы на кинетику действия иммобилизованного ахимотрипсина.
3.2.1. Влияние температуры на гидролиз различных субстратов ахи.мотрипенноы. иммобилизованным в полиНИПАЛгель
3.2.2. Кинетическое поведение нативных ферментов в водноорганических смесях .
3.2.3. Кинетическое поведение иммобилизованных ферментов в смесях
вода ДМСО
3.2.4. Совместное влияние температуры и ДМСО на кинетику действия нативного
и иммобилизованного в полиНИПААматрнцу ахимотрипсина.
3.3. Формальнокинетическое описание гидролиза ахимотриисшюм Мацетилзамешенных субстратов в водноорганнчсских смесях
3.4. Применение концепции низкобарьерных водородных связей к функционированию нативных и иммобилизованных ферментов в водноорганических смесях
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Этот вывод полностью подтвержден авторами работ , , которые при помощи метода ИКспсктроскопли показали, что при Т НКТР Т,р доминирующую роль в поддержании структуры полиНИТТАА в водном растворе шрают именно межмолекулярные водородные связи между молекулами воды и карбонильной или амидной группами полимера от общего числа молекулярных взаимодействий. В то же время, вклад внутримолекулярных водородных связей составляет лишь , . Согласно данным при приближении температурных характеристик системы к НКТР наблюдается перераспределение вклада меж и внутримолекулярных водородных связей, и вклад внутримолекулярных взаимодействий приближается к . Однако, этот вывод ставится под сомнение авторами , которые утверждают, что в сколлалсированном полимере только лишь карбонильных групп образуют внутримолекулярные водородные связи с амидными группами, в то время как остальные С0 группы остаются попрежнему связаны с молекулами воды. Такое несоответствие данных, полученных при изучешш однпаковых систем одним и тем же методом исследования, весьма удивительно. Образование гидрофобного ядра при температурном фазовом переходе в полиНИГАА было неоднократно показано методом ДСК . Данные, полученные в этих работах, подтверждают, что именно энтропийно выигрышное разрушение айсберговых структур воды и усиление гидрофобных взаимодействий между изопропильными остатками полимера при повышении температуры являются движущей силой при коллапсе полнНИПАА, хотя авторами предполагается, что не мснсс важную роль при коллапсе могут играть также ВандерВаальсовы взаимодействия и внутримолекулярные водородные связи. Авторами было установлено, что связывание гидрофобного флуоресцентного зонда пирена существенно улучшается при достижении НКТР полимера. При этом, изменение подвижности и интенсивности флуоресценции включенного в полимер зонда пирена , или метки аценафгилена также свидетельствуют о гилрофобизации полимерных цепей. В работе 9 было показано, что в ряду лолннзопропилакриламид полинизопропилакриламнд полицнклопропилакриламид теплота фазового перехода существенно понижается, что коррелирует с ослаблением гидрофобных взаимодействий при уменьшении площади контакта между боковыми радикалами полимера. Исследование фазового перехода полнНИПАА при помощи ИКспсктроскопии подтвердило, что повышение температуры выше НКТР приводит к тому, что вклад гидрофобных взаимодействий в стабилизацию структуры сколлапсированного полиНИПАА увеличивается в 1. Т НКТР Т в растворитель экспонировании именно гидрофобные изопропильные радикалы . Таким образом, при Т НКТР Т структура полимера или гидратированной трехмерной полимерной сетки полиНИПАА поддерживается за счет межмолекулярных водородных связей, а фазовый переход происходит за счет образования как гидрофобных, гак и водородных внутримолекулярных связей. Молекулы воды могут связываться с полимерными цепями полиНИПАА двумя способами либо за счет водородных связей с их гидрофильными частями, либо образуя айсберговыс структуры вокруг их гидрофобных частей. Проведенный расчет количества связанной воды в полиНИПАА в набухшем состоянии и при коллапсе полимера показывает, что большая часть связанной воды в гидратированном полимере присутствует в айсберговых структурах, а меньшая задействована в образовании межмолекулярных водородных связей . Как было указано ныше, и межмолекулярные водородные связи и айсберговые структуры частично или полностью разрушаются при фазовом переходе. Известно, что взаимодействия между полимерными цепями при коллапсе в полиНИПАА значительно ограничивают подвижность тех молекул волы, которые остаются связанными с полимером . Остается под вопросом количество связанной воды в сколлапсированном геле. В исследовании было показано, что лаже в сколлапсированном полиНИПАА при температурах, превышающих НКТР на С, присутствуют кластеры молекул воды, обладающие упорядоченной структурой. Согласно данным , при коллапсе полиНИПАА около сайтов возможного связывания воды оказывается занято полимерными цепями, а общее содержание связанной воды при ТТкр составляет 0. В то же время, по данных ИКспектросконии, даже в полностью сколлапснрованной трехмерной структуре полиНИПАА сохраняется около 0. По данным ЯМРспсктроскопин, понижение степени гидратации полиНИПАА до критической величины 0. Теоретическое описание фазового перехода в стнмулчувсгвнтсльнмх гелях.